Dokument: Phylogenie, Evolution und strukturelle Basis der lichtabhängigen Protochlorophyllid Reduktion in aerob anoxygenen phototrophen Bakterien

Titel:	Phylogenie, Evolution und strukturelle Basis der lichtabhängigen Protochlorophyllid Reduktion in aerob anoxygenen phototrophen Bakterien
Weiterer Titel:	Phylogeny, evoultion and structural basis of the light dependent protochlorophyllide reduction in aerob anoxygenic phototrophic bacteria
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=48332
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20200211-100943-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schneidewind, Judith [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 29,71 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.01.2019 / geändert 21.01.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Martina Pohl [Gutachter]
Stichwörter:	Protochlorophllid, Oxidoreduktasen, lichtabhängige Enzyme, Chlorophyllbiosynthese, Evolution, aerob anoxygene phototrophe Bakterien, Photosynthese, Protochlorophyllide, Chlorophyll biosynthesis, light-driven enzyme, photosynthesis, SAXS, AUC
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Photosynthese ist einer der bedeutsamsten biochemischen Prozesse auf der Erde und ist aus evolutionärer Sicht als entscheidend für die Entwicklung des Lebens in seiner heutigen Form anzusehen. Für die Photosynthese sind Pigmente wie z. B. (Bakterio-)Chlorophylle essentiell, wobei lichtabhängige Protochlorophyllid-Oxidoreduktasen (LPORs) Schlüsselenzyme für deren Synthese darstellen. LPORs benötigen Licht und den Kofaktor Nicotinamidadenindinukleotidphosphat (NADPH) für die Reduktion der (Bakterio-)Chlorophyll Vorstufe Protochlorophyllid (Pchlid). Die Entstehungsgeschichte von LPORs ist eng mit der Entwicklung der Photosynthese verbunden. Derzeit wird angenommen, dass LPORs vor ca. 2,5 Milliarden Jahren in Cyanobakterien als Anpassung an den steigenden Sauerstoffgehalt der Atmosphäre entstanden sind. Diese Hypothese beruht hauptsächlich auf dem Verbreitungsmuster von LPORs und deren Fehlen in anoxygenen phototrophen Mikroorganismen. Abweichend von dieser Hypothese konnten Kaschner et al. [1] 2014 eine funktionelle LPOR in einem aerob anoxygenen phototrophen Bakterium (AAPB) identifizieren. Zur Zeit dieses Fundes waren keine weiteren LPORs in AAPBs bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit konnten in verschiedenen Datenbanken 27 neue putative LPORs in AAPBs identifiziert werden. Zwölf dieser putativen LPORs wurden in dieser Arbeit heterolog produziert, wenn möglich gereinigt und auf ihre Funktion hin untersucht. Auf diese Weise konnte für neun dieser zwölf putativen Enzyme in vitro eindeutige LPOR-Aktivität nachgewiesen werden. Sieben gut zu reinigende AAPB LPOR-Enzyme wurden anschließend, im Vergleich mit einer pflanzlichen LPOR aus Arabidopsis thaliana (AtLPORC) und der cyanobakteriellen LPOR aus Thermosynechococcus elongatus (TeLPOR), eingehender biochemisch charakterisiert. Hierbei wurden Temperatur- sowie pH-Aktivitätsoptima, Temperaturstabilitäten, Substratpräferenz und die Dissoziation des ternären LPOR/NADPH/Pchlid-Komplexes analysiert. Hinsichtlich dieser Parameter konnten, mit einigen wenigen Ausnahmen, deutliche Unterschiede zwischen den AAPB LPORs und den cyanobakteriellen und pflanzlichen Enzymen nachgewiesen werden. Untersuchungen mittels Kleinwinkel-Röntgenstreuung (englisch: small-angle X-ray scattering, SAXS) zeigten zudem eine global konservierte Struktur zwischen AAPB LPORs und der cyanobakteriellen TeLPOR. In einem, basierend auf einem LPOR-Sequenzalignment rekonstruierten, phylogenetischen Stammbaum bilden die AAPB LPORs eine monophyletische Gruppe, was, zusammen mit den zu den pflanzlichen und cyanobakteriellen LPORs unterschiedlichen biochemischen Eigenschaften, die Vermutung nahe legt, dass es sich bei AAPB LPORs um eine evolutionär und strukturell konservierte Enzymfamilie handelt. Aus evolutionärer Sicht kann hierbei die Anwesenheit von funktionellen LPORs in AAPBs nicht mittels eines einzigen horizontalen Gentransfers (HGT) von einem Cyanobakterium, wie in der Arbeit von Kaschner et al. [1] postuliert, erklärt werden. Vielmehr sind zur Erklärung der erhaltenen Stammbaumtopologie mehrere HGTs notwendig, wobei bei Betrachtung eines datierten Stammbaums, welcher die Evolution der entsprechenden Bakteriengattungen widerspiegelt, eine unabhängige konvergente Evolution von LPORs in AAPBs zumindest gleich wahrscheinlich erscheint. Obwohl LPORs bereits seit mehr als 50 Jahren untersucht werden, konnte bisher keine LPOR-Kristallstruktur gelöst werden, was weiterführende Untersuchungen zur Bildung des ternären LPOR/NADPH/Pchlid-Komplexes sowie des Reaktionsmechanismus erschwert. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit versucht, verschiedene LPOR-Enzyme zu kristallisieren, wobei für einige Enzyme zwar Kristalle erhalten werden konnten, die Kristallqualität jedoch bisher eine Strukturlösung in hoher Auflösung unmöglich macht. Aus diesem Grund wurde im Rahmen dieser Arbeit die Struktur und Dynamik des cyanobakteriellen TeLPOR-Enzyms in Lösung mittels SAXS und inkohärenter quasielastischer Neutronenstreuung (incoherent quasielastic neutron scattering, QENS) untersucht. Hierbei konnte erstmals ein niedrigauflösender Einblick in die Struktur des monomeren LPOR-Apoproteins gewonnen werden, sowie mittels Homologiemodellierung ein physikalisch sinnvolles Modell des Volllängenproteins vorgeschlagen werden. Basierend auf SAXS und analytischen Ultrazentrifugations-Untersuchungen konnte zudem eindeutig nachgewiesen werden, dass die Bildung des ternären LPOR/NADPH/Pchlid-Holoprotein-Komplexes zu einer Dimerisierung des Enzyms führt. Mittels QENS konnte außerdem erstmals gezeigt werden, dass dynamische Prozesse im ps- bis ns-Bereich eine wichtige Rolle bei der Bildung des ternären LPOR/NADPH/Pchlid-Komplexes spielen, sowie dass die „Aktivierung“ des ternären Komplexes mittels Licht zu einer Änderung der Proteindynamik führt, was einen Zusammenhang zwischen Proteindynamik und Katalyse nahelegt. [1] Kaschner, M., Loeschcke, A., Krause, J., Minh, B. Q., Heck, A., Endres, S., Svensson, V., Wirtz, A., von Haeseler, A., Jaeger, K. E., Drepper, T. and Krauss, U. (2014) Discovery of the first light-dependent protochlorophyllide oxidoreductase in anoxygenic phototrophic bacteria. Molecular Microbiology. 93(5): p. 1066-1078. Photosynthesis is one of the most important biochemical processes on earth. From an evolutionary perspective, the development of photosynthesis was crucial for the development of life in its present form. Pigments like (bacterio-)chlorophylls are essential for photosynthesis, with light dependent protochlorophyllide oxidoreductases (LPORs) representing key enzymes for their synthesis. LPORs need light and the cofactor nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) for the reduction of the (bacterio-)chlorophyll precursor protochlorophyllide (Pchlide). The evolutionary origin of LPORs is hereby closely linked to the development of photosynthesis. Currently it is assumed that LPORs arose approximately 2.5 billion years ago as adaption to the rise of the atmospheric oxygen level. This hypothesis is mainly based on the distribution pattern of LPORs and its absence in anoxygenic phototrophic microorganisms. In contrast to this hypothesis, Kaschner et al. [1] recently identified a functional LPOR in an aerobic anoxygenic phototrophic bacterium (AAPB). At this time no further putative LPORs could be found in AAPBs. Within the scope of this thesis 27 new putative LPORs from AAPBs were identified in different databases. Twelve of them were heterologously produced, purified if possible and tested for their functionality. Hereby, using an in vitro assay, LPOR activity could clearly be proven for nine of the enzymes. Subsequently, seven AAPB LPOR enzymes, that could easily be purified, were biochemically characterized in comparison to the plant LPOR of Arabidopsis thaliana (AtLPORC) and the cyanobacterial LPOR of Thermosynechococcus elongatus (TeLPOR). Here, temperature and pH activity optima, temperature stabilities, substrate preferences and the dissociation of the ternary LPOR/NADPH/Pchlide complex were analyzed. With regard to these parameters distinct differences between AAPB LPORs and the cyanobacterial and plant enzymes could be proven with a few exceptions. Furthermore, small-angle X-ray scattering (SAXS) studies revealed a conserved global structure of AAPB LPORs and the cyanobacterial TeLPOR. In a phylogenetic tree that was reconstructed from an LPOR sequence alignment, AAPB LPORs form a monophyletic group. Together with their different biochemical properties this observation warrants the assumption that AAPB LPORs represent a novel evolutionary and structurally conserved group of LPOR enzymes. In evolutionary terms the presence of functional LPORs in AAPBs cannot be explained by a single horizontal gene transfer (HGT) like Kaschner et al. [1] postulated. Instead several HGTs are necessary to explain the observed tree topology, whereby the consideration of a dated tree which reflects the evolution of the LPOR-containing bacterial genera, independent convergent evolution of LPORs in AAPBs appears to be at least equally probable. Although LPORs have been known and investigated for more than 50 years, no crystal structure of an LPOR enzyme has been solved to date, which makes further investigations into the formation of the ternary LPOR/NADPH/Pchlid complex and the reaction mechanism difficult. Therefore, as part of this thesis, crystallization trials were carried out for different LPOR enzymes. While, for some enzymes crystals could be obtained, the present crystal quality was insufficient to enable the determination of a high-resolution LPOR structure. Hence, the structure and dynamics of the cyanobacterial TeLPOR enzyme was investigated in solution by the use of SAXS and incoherent quasielastic neutron scattering (QENS). Those studies enabled a first low-resolution glimpse into the structural architecture of the monomeric LPOR apo-protein. Furthermore, a physically meaningful model of the full-length protein could be suggested by homology modelling. Based on SAXS and analytical ultracentrifugation studies it could clearly be proven that the formation of the ternary LPOR/NADPH/Pchlide holo-protein complex results in dimerization of the enzyme. Using QENS, dynamic processes in ps to ns range could for the first time be shown to play an important role for the formation of the LPOR/NADPH/Pchlid ternary complex. Furthermore it could be shown that “activation” of the ternary complex by light leads to changes in the protein dynamics, providing a link between protein dynamics, ternary complex formation and catalysis. [1] Kaschner, M., Loeschcke, A., Krause, J., Minh, B. Q., Heck, A., Endres, S., Svensson, V., Wirtz, A., von Haeseler, A., Jaeger, K. E., Drepper, T. and Krauss, U. (2014) Discovery of the first light-dependent protochlorophyllide oxidoreductase in anoxygenic phototrophic bacteria. Molecular Microbiology. 93(5): p. 1066-1078.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Enzymtechnologie
Dokument erstellt am:	11.02.2020
Dateien geändert am:	11.02.2020
Promotionsantrag am:	10.09.2018
Datum der Promotion:	05.11.2018