Dokument: Klassisches, trans- und cluster-signaling durch HIL-6 und membrangebundene HIL-6 (mbHIL-6) Varianten und Identifizierung von neuen konstitutiven gp130 Varianten
| Titel: | Klassisches, trans- und cluster-signaling durch HIL-6 und membrangebundene HIL-6 (mbHIL-6) Varianten und Identifizierung von neuen konstitutiven gp130 Varianten | |||||||
| Weiterer Titel: | Classic, trans- and cluster-signaling via HIL-6 and membranebound HIL-6 (mbHIL-6) variants and identification of new constitutive active gp130 variants | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=48322 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20190128-091747-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | M.Sc. Lamertz, Larissa [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Scheller, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. William Martin [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | gp130, Interleukin-6, cluster-signaling, trans-signaling, klassisches signaling, konstitutiv aktiv | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Interleukin (IL-)6 ist ein wichtiger Regulator von entzündlichen Prozessen. Die Signalwei-terleitung von IL-6 erfolgt über den membrangebundenen (klassisches signaling) oder den löslichen (Trans-signaling) Interleukin-6 Rezeptor (IL-6R). Dieser Komplex aus IL-6:IL-6R bindet an das signalweiterleitende, ubiquitär exprimierte Glykoproteine gp130. Kürzlich wurde gezeigt, dass es eine dritte signaling Art gibt, das Cluster-signaling. Es wird vermittelt durch IL-6:IL-6R Transmitter-Zellen, die gp130 auf Empfänger-Zellen aktivier-ten. Lösliches gp130 ist der spezifische Inhibitor des Trans-signalings. Warum sgp130(Fc) nicht dazu in der Lage ist, klassisches IL-6 signaling zu hemmen, war zu Beginn dieser Studie völlig unklar. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von sgp130Fc mit natürlichen membrangebundenen IL-6:IL-6R Komplexen gezeigt. Diese Interaktion vermittelte die Hemmung des Cluster-signalings durch sgp130Fc. Zur Untermauerung dieser Ergebnisse wurden neuartige membranständige IL-6:IL-6R-Fusionsproteine geschaffen, in denen das IL-6 durch flexible Peptidlinker an den IL-6R fusioniert und damit in der klassichen sig-naling Position fixiert ist (Chen et al., 2013). Auch an diese membranständigen Hyper-IL-6-Proteine konnte sgp130Fc binden.
Interleukin-11 gehört zur Interleukin-6 Familie und wurde in dieser Arbeit untersucht. Da-bei wurde gezeigt, dass sgp130Fc auch membranständige IL-11:IL-11R-Komplexe und Hyper-IL-11-Komplexe binden und hemmen kann. Somit ist sgp130Fc auch ein Inhibitor des Trans-signalings und Cluster-signalings von IL-11. Durch die Untersuchung wurde gezeigt, dass keine sterische Hinderung bei der Bindung von sgp130Fc an membrangebun-dene IL-6:IL-6R bzw. IL-11:IL-11R Komplexe vorliegt. Für die weitere Untersuchung, warum sgp130Fc klassisches signaling nicht hemmt, wurde das autokrine signaling durch die Koexpression von gp130 und entweder IL-6:IL-6R, membranständigem Hyper-IL-6 oder löslichem Hyper-IL-6 auf Zellen untersucht. Interessanterweise konnte autokrines signaling durch externe Inhibitoren wie sgp130Fc nicht gehemmt werden. Jedoch wurde eine Inhibition durch intrazelluläre Inhibitoren gezeigt. Dadurch kam die Vermutung auf, dass es hierbei bereits in der Zelle zur Signalinitiantion kommt. Zukünftige Studien werden untersuchen, ob nicht nur gp130 in der Membran als präformierte Komplexe vorliegt, son-dern auch der IL-6R Teil dieser Komplexe ist und daher sgp130Fc aufgrund der einzigarti-gen Bindungsstöchiometrie und Abfolge (IL-6 site I bindet an den IL-6R und dann bindet site II von IL-6 Domäne 1 von gp130 und site III Domäne 2 und 3 von gp130) keine Gele-genheit hat, an einmal gebildete IL-6:IL-6R:gp130 Komplexe auf der Zelloberfläche zu binden. Ein wichtiges Mitglied der IL-6 Familie ist der gp130 Rezeptor. Gp130 besteht aus 6 ext-razellulären Domänen, die über eine Stalkregion von 6 Aminosäuren mit der Transmemb-randomäne und der intrazellulären Domäne verknüpft sind. Domäne 1 bis 3 werden für die Bindung der Zytokine benötigt. Domäne 4 bis 6 werden für die Aktivierung von gp130 benötigt, damit die Januskinasen nach erfolgter Bindung des Zytokins aktiviert werden können. Es wurde vorher gezeigt, dass durch den Austausch des gesamten extrazellulären Bereichs von gp130 durch kurze Leucin-Zipper, ligandenunabhängige, konstitutiv aktive synthetische gp130 Rezeptoren erzeugt werden konnten. Später wurde gezeigt, das kleine in-frame Deletionen in der Domäne 2 von gp130 ebenfalls zu konstitutiv aktiven gp130 Rezeptoren führt. Für den IL-23R wurde nun kürzlich gezeigt, dass die Deletion der Stal-kregion zu einer ligandenunabhängigen, konstitutitven Aktivierung eines homodimeren IL-23R-Komplexes führt Es sollte daher untersucht werden, ob auch der verwandte gp130 Rezeptor durch Deletionen der Domänen 4 bis 6 mit oder ohne Deletion der Stalkregion konstitutiv aktiviert werden kann. In dieser Arbeit wurde nun gezeigt, dass Deletionen ab der Hälfte der Stalkregion in Kombination mit der Deletion der Domänen 4 bis 6 zu konsti-tutiv aktiven gp130 Varianten führt. Eine weitere Erkenntnis dieser Arbeit ist, dass die alleinige Deletion der Stalkregion um 3 Aminosäuren keine Auswirkung auf die signaling Aktivität von gp130 hat. Zudem wurde gezeigt, dass die Deletion der Domäne 4 bis 6 zu inaktiven gp130 Varianten führt. Für die konstitutiv aktiven Varianten wurde gezeigt, dass HIL-6-Fc immer noch in der Lage ist, den Komplex zu binden. Die Ergebnisse in dieser Studie zu gp130 zeigen einen neuartigen Weg, wie konstitutiv aktive Rezeptoren durch Deletionen im extrazellulären Rezeptorbereich erstellt werden können.Interleukin-6 (IL-6) is a very important regulator of inflammatory processes. IL-6 signals via a membrane-bound or soluble IL-6 receptor (IL-6R) and the signal transducing gp130, which is referred to as classic or trans-signaling, respectively. Recently, cluster signaling was discovered, which is mediated by membrane-bound IL-6:IL-6R-complexes on trans-mitter cells triggering gp130 receptor activation on neighboring receiver cells. The soluble form of gp130 (sgp130) emerged as selective trans-signaling inhibitor. It is not affecting classic signaling, but the reason for this is not known. Here we demonstrate interaction of sgp130 with membrane-bound IL-6:IL-6R complexes, which resulted in inhibition of clus-ter-signaling. In addition to these results, we designed synthetic membrane bound IL-6:IL-6R fusion proteins, in which IL-6 is fused to IL-6R by a flexible peptide linker, so that this complex is fixed in a classic-signaling position. Also the interaction of sgp130Fc and blockade of cluster-signaling for this complex was shown. Interleukin-11 is a member of the Interleukin-6 Family and was also analyzed here. In line, sgp130Fc can interact with membrane-bound IL-11:IL-11R complexes and membrane-bound HIL-11 complexes. So sgp130Fc also inhibits trans- and cluster-signaling of IL-11. The first outcome is that there is no steric hindrance in the interaction of sgp130Fc with IL-6:IL-6R or IL-11:IL-11R complexes. To further investigation, why sgp130Fc cannot affect classic signaling, we coexpressed gp130 and IL-6:IL-6R, membrane bound HIL-6 or solu-ble HIL-6 in the same cell to mimic an autocrine signaling. Interestingly, autocrine classic signaling was not inhibited by extracellular inhibitors such as sgp130 or antibodies directed against IL-6R or gp130. Interestingly intracellular JAK inhibitors suppressed autocrine signaling. We concluded that signal initiation occurs already from within the cell. Future studies have to investigate, if there are not only preformed gp130 complexes, but pre-formed gp130:IL-6R complexes. This might be the reason why sgp130Fc cannot inhibit classic signaling, because of the unique binding stoichiometry (IL-6 site I binds to the IL-6R and then IL-6 site II binds domain 1 of gp130 and then site III binds domain II and III of gp130) suggesting an intracellular activation mode of gp130 for autocrine signaling de-pending on that there is no chance for sgp130Fc to bind IL-6:IL-6R:gp130 complexes on the cell surface. One major player of the IL-6 family of cytokines is gp130. Gp130 consists of 6 extracellu-lar domains, which are bound via a 6 amino acid long stalk region to the transmembrane domain and the intracellular domain of gp130. For the binding of cytokines the domain 1 to 3 is needed. Domain 4 to 6 is used for the activation of gp130, so that the janus kinases can get activated after cytokine binding. Previously it was shown, that exchange of the extracellular part of gp130 to short leucin-zippers generates ligand independent, constitu-tive active synthetic gp130 receptors. Later it was shown, that small in-frame deletions in domain 2 resulted in constitutive activation of gp130 receptors. Recently, it was shown for the IL-23R that deletion of the stalk region resulted in a ligand independent constitutive active form of the homodimeric IL-23R. It was investigated, if the gp130 receptor gets constitutive active, when domain 4 to 6 with or without the stalk region is deleted. Here we show that deletions of more than half of the stalk region in combination with a deletion of the domains 4 to 6 resulted in constitutive active variant of gp130. A second outcome was that the deletion of the half of the stalk region has no effect on the signaling activity of gp130. Additionally it was shown, that deletion of domain 4 to 6 resulted in inactive forms of gp130. For the constitutive active variant of gp130 it was shown, that HIL-6-Fc is still able to bind the complex on the cell surface. Here we showed a new way to create constitutive active cytokine receptor variants, caused by deletions in the extracellular part of the receptor. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie II | |||||||
| Dokument erstellt am: | 28.01.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 28.01.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 13.08.2018 | |||||||
| Datum der Promotion: | 14.01.2019 |
