Dokument: Establishing an in vitro system for the ABC transporter Pleiotropic Drug Resistance 8 from Arabidopsis thaliana

Titel:	Establishing an in vitro system for the ABC transporter Pleiotropic Drug Resistance 8 from Arabidopsis thaliana
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=48301
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190118-091635-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Gräfe, Katharina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 16,63 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.01.2019 / geändert 17.01.2019
Beitragende:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Als sessile Organismen sind Pflanzen einer Vielzahl von Stressfaktoren ausgesetzt. Obwohl sie darauf nicht durch Relokalisierung reagieren können schützen sie sich durch die Aktivierung von Verteidigungs- und Signalstoffwechselwegen. Diese beinhalten Mechanismen zur Entgiftung sowie zur Verteidigung gegen pathogene und herbivore Organismen. Es wurde gezeigt, dass „ATP-binding cassette“ (ABC)-Transporter an diesen Prozessen beteiligt sind. Interessanterweise beinhalten Pflanzen eine Vielzahl an ABC-Proteinen im Vergleich zu Organismen der anderen Reiche und auch im Vergleich zu Mikroalgen, den Vorfahren von Pflanzen. Daher wird vermutet, dass während der Anpassung der Landpflanzen an die sessile Umgebung ABC-Transporter-Gene multipliziert wurden und neue Funktionen entwickelt haben. Der Transporter PDR8 aus Arabidopsis thaliana gehört zu der Familie der ABC-Transporter mit pleiotropischer Wirkstoffresistenz (englisch: Pleiotropic drug resistance, PDR), welche bisher nur in Pflanzen und Pilzen entdeckt wurden. AtPDR8 ist in der Plasmamembran lokalisiert und durch Mutationsstudien und reverse Genetik an A. thaliana wurde herausgefunden, dass AtPDR8 an diversen physiologische Prozessen beteiligt ist. Dazu gehören Entgiftung, Hormontransport, Resistenz gegen Salz und Trockenheit sowie Pathogenabwehr. Des Weiteren wurde gezeigt, dass AtPDR8 eine Schlüsselfunktion in der Resistenz von Nicht-Wirtspflanzen einnimmt. Die Physiologischen Studien weisen darauf hin, dass AtPDR8 eine Vielzahl verschiedener Substanzen transportiert. Allerdings fehlt der direkte Nachweis für diese Hypothese und es kann daher nicht ausgeschlossen werden, dass AtPDR8 nur eine einzige, Stress-induzierbare Substanz transportiert. Darüber hinaus existieren widersprüchliche Studien bezüglich der Rolle von AtPDR8 in der Pflanzenimmunität. Das Wissen über die transportierten Substrate würde Aufschluss über die tatsächliche physiologische Rolle von AtPDR8 geben. Dazu werden biochemische Analysen und die Etablierung eines In vitro-Systems benötigt um zu verhindern, dass andere Proteine die Charakterisierung stören. Diese Arbeit zielte auf die Etablierung eines In vitro-Systems des ABC-Transporters PDR8 ab. Für die Umsetzung mussten folgende Schritte realisiert werden: 1) Klonierung, 2) Heterologe Expression, 3) Proteinreinigung, 4) Rekonstitution sowie 5) die Etablierung einer Transportanalyse. Das PDR8-Gen wurde in Expressionsvektoren für pro- und eukaryotische Systeme kloniert. Dabei wurden verschiedene Affinitätsmarkierungen an den C- oder N-terminus der Proteinsequenz angefügt. Während der Klonierungs- und Expressionsstudien wurde deutlich, dass AtPDR8 möglicherweise toxisch für die getesteten pro- und eukaryotischen Systeme ist. Aus diesem Grund wurden verschiedene Klonierungsstrategien und Stämme analysiert. Die Expression mit N-terminaler Markierung war erfolgreich in der Hefe Pichia pastoris. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein pflanzlicher ABC-Transporter in P. pastoris exprimiert, wobei die Position der Affinitätsmarkierung entscheidend für die erfolgreiche Expression war. Durch Dichtegradientenzentrifugation und konfokaler Fluoreszenzmikroskopie konnte gezeigt werden, dass AtPDR8 auch in P. pastoris in der Plasmamembrane lokalisiert ist. Daher kann angenommen werden, dass das Protein korrekt gefaltet und prozessiert wurde. Anschließend wurde AtPDR8 aufgereinigt, wofür das Protokoll in dieser Arbeit erstellt wurde. Dazu wurden verschiedene Detergenzien analysiert sowie verschiedene Ansätze der Affinitätschromatographie in Kombination mit Größenausschlusschromatographie. Das Protokoll für die Rekonstitution von AtPDR8 in Liposomen wurde ebenfalls etabliert. Dazu wurde die Herstellung von Liposomen aus verschiedenen Lipidansätzen, die Optimierung der Liposomendestabilisierung und die Integration von AtPDR8 in die Liposomen untersucht. Der Erfolg der Rekonstitution konnte durch Dichtegradientenzentrifugation bestätigt werden. In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal ein PDR-Transporter aus A. thaliana gereinigt und rekonstituiert. Um zu klären welche Substrate transportiert werden und um unbekannte Substrate zu identifizieren, wurde eine Transportanalyse etabliert, welche die Verwendung eines Komponentengemischs, wie zum Beispiel ein zytosolischer Extrakt, ermöglicht. Dazu wurde der Transporter Pdr5 aus Saccharomyces cerevisiae verwendet, da dessen Substrate schon studiert wurden. Die Etablierung umfasste die Evaluation der optimalen Transportbedingungen sowie die Analyse verschiedener Methoden zum Membranvesikelaufschluss. Der Einsatz von Tandem-Massenspektroskopie ermöglicht die Identifikation unbekannter Substanzen, selbst wenn diese in geringen Konzentrationen vorliegen. Das durch dieses Projekt gewonnene Wissen erleichtert die Etablierung weiterer in vitro-Systeme für Volllängen-ABC-Transporter. Mehrere eukaryotische ABC-Transporter weisen breite Substratspektren auf. Daher werden in vitro-Systeme benötigt um die Transporter biochemisch zu charakterisieren in Bezug auf die Substratspezifität und die Transportcharakteristika. As sessile organisms plants are exposed to many environmental stressors. Although they cannot move they react to their environment by activating stress response and signaling pathways. This response includes detoxification mechanisms as well as herbivore and pathogen response. ATP-binding cassette (ABC) transporters were shown to be involved in all these processes. Interestingly, plants contain high numbers of ABC transporters compared to organisms from other kingdoms and also compared to microalgae, the ancestor of plants. Therefore it was hypothesized that ABC transporter genes multiplied and obtained new functions during the adaption of plants to the sessile lifestyle on dry land. The plasma membrane ABC transporter PDR8 from Arabidopsis thaliana belongs to the Pleiotropic Drug Resistance (PDR) family, which only exists in plants and fungi. Applying mutant studies and reverse genetics the protein was shown to be involved in diverse physiological processes including heavy metal detoxification, hormone transport, drought and salt resistance and pathogen response. AtPDR8 was furthermore assigned a key role in nonhost resistance in A. thaliana. The physiological studies imply that AtPDR8 transports a variety of structurally unrelated compounds. However, this hypothesis lacks direct evidence and the possibility that AtPDR8 transports only one stress-inducible compound cannot be excluded at the moment. Additionally, contradictory results exist complicating the understanding of AtPDR8 function in plant immunity. Knowledge about the transported substrate(s) will help to clarify the physiological role of the transporter. This requires biochemical studies and the establishment of an in vitro system to ensure that interfering processes do not mask the role of the transporter. This project aimed the establishment of an in vitro system for the ABC transporter AtPDR8. To realize this, five steps were required: 1) Cloning, 2) Heterologous expression, 3) Purification, 4) Reconstitution into liposomes and 5) Establishment of a suitable transport assay. The AtPDR8 gene was cloned into expression vectors for prokaryotic and eukaryotic systems and different affinity tags were fused to the N- or the C-terminus of the protein sequence. During the cloning and expression tests potential toxicity of AtPDR8 to the (pro- and eukaryotic) hosts was encountered resulting in the need to explore multiple cloning strategies and strains. Expression of a construct with N-terminal affinity tags was successful in the yeast Pichia pastoris. In this study, for the first time a plant ABC transporter was expressed in P. pastoris. However, the position of the tag was crucial for successful overexpression. Density gradient centrifugation and confocal fluorescence microscopy could show that AtPDR8 was targeted to the plasma membrane in P. pastoris, which implies correct folding and processing of the protein. AtPDR8 was subsequently purified, for which the purification protocol was established. That included the screening of different detergents as well as a screening of different affinity chromatography approaches and the evaluation of a size exclusion chromatography. The reconstitution protocol for AtPDR8 was also established, which comprised the liposomes preparation using different lipid compositions, the optimization of the destabilization process and the integration of AtPDR8 into the liposomes. Floating density gradient centrifugation could proof the success of the reconstitution. This study represents the first purification and reconstitution of a PDR transporter from A. thaliana. In order to clarify which substrates are transported and to identify unknown substrates of the transporter a transport assay was established, which allows the usage of a mixture of unknown compounds, e.g. cytosolic extracts. The establishment required the evaluation of optimal conditions for the transport reaction and the evaluation of different methods for the disruption of membrane vesicles. Tandem mass spectrometry even allows the identification of transported compounds of low abundance. The knowledge gained in this project will facilitate the establishment of in vitro systems for other plant full-size ABC transporters. Since several eukaryotic ABC transporters display broad substrate spectra these systems will be needed to biochemically characterize the transporters regarding substrate specificity and transport characteristics.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	18.01.2019
Dateien geändert am:	18.01.2019
Promotionsantrag am:	24.08.2018
Datum der Promotion:	17.10.2018