Dokument: Detektion von mycobakteriellen Erregern bei Lymphadenopathien unklarer Ätiologie im Kindesalter
| Titel: | Detektion von mycobakteriellen Erregern bei Lymphadenopathien unklarer Ätiologie im Kindesalter | |||||||
| Weiterer Titel: | Detection of mycobacterial pathogens in children with lymphadenopathy of unknown etiology | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=48091 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20190103-110845-5 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Chung, Da-Un [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof.Dr. Jacobsen, Marc [Gutachter] Prof. Dr. MacKenzie, Colin R. [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Die zervikale Lymphadenopathie (LAP) im Kindesalter stellt eine der häufigsten Symptome im pädiatrischen Klinikalltag dar. In den meisten Fällen handelt es sich um eine reaktive LAP durch bakterielle oder virale Infektionen, aber auch onkologische und immunologische Ursachen sind nicht selten. Aufgrund der unterschiedlichen therapeutischen Konsequenzen der Ursachen
besteht die Dringlichkeit einer zügigen und korrekten Diagnosestellung. Speziell die Differentialdiagnostik der mycobakteriellen LAP stellt aufgrund der unspezifischen Klinik und des schwierigen kulturellen Nachweises der verschiedenen Erreger ein kritisches Problem dar. Die Kreuzreaktivität der diagnostisch verfügbaren mycobakteriellen Proteinextrakte (PPD) limitiert bislang u.a. die Möglichkeiten einer zuverlässigen immunologischen Differenzierung. Magdorf et al. gelang es dennoch durch den differentiellen Einsatz von mycobakteriellen PPD nichttuberkulöse Mycobakterien (NTM) und M. tuberculosis (MTB) als auslösenden Erreger in unterschiedlichen Patientenpopulationen mit LAP zu zuzuordnen. Das Ziel dieser Arbeit war die Etablierung einer sensitiven und spezifischen Methode für den immunologischen Nachweis von NTM als Ursache einer LAP unklarer Ätiologie im Kindesalter. Es sollte untersucht werden, ob die komparative Analyse von Zytokinantworten stimulierter T-Zellen auf verschiedene mycobakterielle PPD zur Identifizierung von NTM beiträgt. Darüber hinaus sollten der Einfluss unterschiedlicher Stimulationsansätze auf die Effektivität der Methode geprüft, sowie neue Zytokine identifiziert werden, welche für weitere immunologische Tests geeignet sein könnten. Es wurde ein Studienkollektiv von 25 Kindern rekrutiert und in die Gruppen „NTM-LAP“ für Patienten mit nachgewiesener mycobakterieller Ursache ihrer LAP, „Non-NTM-LAP“ für Patienten mit nachgewiesener, nicht-mycobakterieller Ursache ihrer LAP und in die Gruppe der „Verdachtsfälle“ für Patienten mit LAP unklarer Ätiologie zugeordnet. Aus heparinisierten Vollblutproben wurden mononukleare Zellen (PBMC) isoliert, welche sowohl in Kurzzeit- Stimulationsansätzen, als auch in Langzeit-Restimulationsansätzen mit PPD Tuberculin und PPD Sensitin in vitro inkubiert wurden. Nach intrazellulärer Zytokinfärbung (ICS) folgte die durchflusszytometrische Untersuchung auf spezifische Zytokinantworten. Des Weiteren wurden Überstände aus PBMC-Kulturen und Vollblut-Proben ebenfalls mit mycobacteriellen PPD in vitro inkubiert und die gewonnenen Überstände mit CBA und ELISA auf spezifische Zytokinprofile untersucht. In der Durchflusszytometrie zeigten 4/4 Patienten der „NTM-LAP“-Gruppe eine deutlich höhere Zytokinantwort i.S. einer IFN-γ/TNF-α Ko-Expression auf PPD Sensitin, als auf PPD Tuberculin. In der Gruppe der „Verdachtsfälle“ zeigten 4/7 Patienten, in der „Non-NTM-LAP“- Gruppe 1/8 entsprechende Zytokinantworten. Die Langzeit-Restimulation führte zu einer deutlichen Steigerung der stimulierten Zytokinantworten. Im CBA und ELISA zeigten sich nur für IFN-γ im stimulierten Vollblut spezifische Konzentrationen, welche auf eine NTM-Infektion zurückzuführen waren. Für IP-10 im stimulierten Vollblut zeigte sich ein tendenzieller Zusammenhang zwischen der gemessenen Zytokinantwort und einer NTM-Infektion. Weitere getestete Zytokine, wie u.a. MIP-1α und TNF-α zeigten keinen solchen Zusammenhang. Zusammenfassend konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass der durchflusszytometrische Nachweis von Zytokinantworten multifunktionaler T-Zellen nach Stimulation mit mycobakteriellen Proteingemischen die Identifizierung von LAP mycobakterieller Genese in pädiatrischen Patienten möglich macht. Die Langzeit-Restimulation führt, unter einem potentiellen Verlust der Spezifität, zu einer Sensitivitätssteigerung der Methode. Neben IFN-γ könnte IP-10 als potentiell neuer Marker zukünftig zur verbesserten Diagnostik mycobakterieller LAP beitragen. Für eine optimierte Immundiagnostik wären weitere Experimente mit multifunktionalen T-Zellen und spezies-spezifischen Antigenen wünschenswert, wie sie bereits in der Tuberkulose-Diagnostik genutzt werden.Cervical lymphadenopathy (LAP) is one of the most common clinical symptoms in day-to-day pediatric clinical practice. In most cases reactive LAP in response to bacterial or viral infections is diagnosed, but oncological or immunological causes are also common. A timely and exact diagnosis is paramount due to the different diagnostic and therapeutic consequences of the many respective etiologies. Especially, LAP caused by mycobacteria poses a diagnostic challenge, because of unspecific symptoms and difficult detection by bacterial culture. The cross-reactivity of the commercially available mycobacterial purified protein derivates (PPD) currently limits the development of sufficient methods for immunological differentiation. Despite this, Magdorf et al. were able to immunologically identify non-tuberculous mycobacteria (NTM) and M. tuberculosis (MTB) as causative pathogens in different patient populations with LAP by utilizing different mycobacterial PPD. The aim of this study was to establish a sensitive and specific immunological method to detect NTM as causative pathogens in pediatric cervical LAP of unknown etiology. Therefore, a comparative cytokine-analysis of stimulated T-cell responses to different mycobacterial PPD was designed, in order to identify NTM-infected patients. Secondary objectives were to test the influence of different stimulation protocols on method efficacy and the identification of novel cytokines, which could be utilized in further studies. We recruited 25 pediatric patients with LAP and divided them into three study groups labeled “NTM-LAP” for patients with confirmed NTM infection, “Non-NTM-LAP” for patients with confirmed non-mycobacterial cause of LAP and “suspected cases” for patients with unknown cause of LAP. Heparinized whole blood specimens were collected in order to isolate mononuclear cells (PBMC). The cells were stimulated in vitro with mycobacterial PPD in short-term incubation assays and in long-term re-stimulation assays. After intracellular cytokine staining (ICS) the cells were then analyzed with flow cytometry for specific cytokine responses. In addition, supernatants of PBMC cultures and whole blood stimulated in vitro with mycobacterial PPD, were collected and analyzed for specific cytokine responses with cytometric bead array (CBA) and enzyme-linked immune-sorbent assay (ELISA). Flow cytometry showed 4 of 4 patients in the “NTM-LAP” group with markedly higher cytokine responses to stimulation with PPD sensitin, in terms of IFN-γ/TNF-α co-expressing T-cells, than to PPD tuberculin. In the group of “suspected cases” 4 of 7 patients and in the “Non-NTM-LAP” group 1 of 8 patients, demonstrated respective cytokine responses. The long-term re-stimulation assay increased the measured cytokine responses markedly. CBA and ELISA revealed IFN-γ as the only cytokine with a specific increase in cytokine concentration to NTM infection in stimulated whole blood. Further analyses showed an association between increased IP-10 concentrations in stimulated whole blood and NTM infection, which did not suffice for statistical significance. The measured concentrations of other tested cytokines, i.a. MIP-1α and TNF-α, did not show any specific associations in these experiments. In summary, this study shows that the specific cytometric detection of T-cell cytokine responses after stimulation with mycobacterial PPD is able to identify mycobacterial causes of LAP in children. The long-term re-stimulation assay improved method sensitivity at the cost of specificity. IP-10 could possibly contribute as a specific marker in the diagnostics of mycobacterial infections. Further research on multi-functional T-cells and the use of species-specific antigens, as already utilized in the diagnostics of tuberculosis, are needed and would greatly advance the immunological and diagnostic methods for mycobacterial infections in the future. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 03.01.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 03.01.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 06.04.2018 | |||||||
| Datum der Promotion: | 13.12.2018 |
