Dokument: Biochemical Characterisation of the Escherichia coli Haemolysin A Type I Secretion System

Titel:	Biochemical Characterisation of the Escherichia coli Haemolysin A Type I Secretion System
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=48087
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20181220-113040-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	MSc Kanonenberg, Kerstin [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 87,62 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 17.12.2018 / geändert 17.12.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Lutz Schmitt [Gutachter] Prof. Dr. Weber, Andreas P. M. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Typ I Sekretionssysteme (T1SS) sind in Gram-negativen Bakterien allgegenwärtige Transportmaschinerien. Das Translokon ist von relativ simpler Bauweise und besteht aus einem ABC Transporter, einem Membranfusionsprotein (MFP) und einem TolC-artigen Porin in der äußeren Membran (OMP). Während der ABC Transporter und das MFP wahrscheinlich einen konstant assemblierten Komplex in der inneren Membran bilden, wird das OMP nur nach Interaktion mit dem Substrat im Cytosol rekrutiert. Der assemblierte Komplex sekretiert sein dediziertes Substrat in einem Schritt und ohne periplasmatische Intermediate, mit dem C-Terminus voran, über beide Membranen in den extrazellulären Raum. Die Substrate von T1SS sind von bemerkenswerter Variabilität bezüglich ihrer Größe und Funktion. Sie haben eine Größe von 5 bis über 800 kDa und beinhalten Bakteriocine, hämolytische Exotoxine, Proteasen, Lipasen, Hämophore oder Adhesine. Verschiedene zusätzliche Domänen an den Transporter-Untereinheiten und zusätzliche Proteine in den Operons sind im Sekretionsprozess involviert. In der vorliegenden Arbeit wurde das Hämolysin A T1SS aus Escherichia coli untersucht. Die ABC Transporter-Untereinheit HlyB, die eine C39 Peptidase-ähnliche Domäne (CLD) an ihrem N-Terminus beinhaltet, wurde gereinigt, in Saposin-A Nanopartikel rekonstituiert und in einer detergenzfreien Umgebung funktionell charakterisiert. Diese Studien zeigten einen starken Einfluss von freien Detergenzmizellen auf die funktionellen Eigenschaften des ABC Transporters. Weiterhin wurde die Überexpression des assemblierten inneren Membrankomplexes, bestehend aus dem ABC Transporter HlyB und des MFPs HlyD, mithilfe eines Zulaufprozesses im Bioreaktor sowie die nachfolgende Reinigung etabliert. Initiale Strukturstudien wurden mittels Negativfärbung-Elektronenmikroskopie durchgeführt. Um Verunreinigungen zu reduzieren und insgesamt die Überexpression von Membranproteinen zu vereinfachen, wurde der neue Expressionsstamm C41(DE3)∆ompF∆acrAB entwickelt. Der Stamm zeigte einen höheren Ertrag und verbesserte Reinheit und Stabilität von integralen Membranproteinen und verhinderte deren Abbau. Abschließend wurde die Dissertation mit bioinformatischen Studien komplettiert, die zum Ziel hatten, die verschiedenen T1SS zu klassifizieren und konservierte Sekretionsmotive in den Substraten zu identifizieren. Eine initiale Studie beschränkte sich hierbei auf die zusätzlichen Domänen der ABC Transporter, die später erweitert wurde, um auch Operonaufbau, potenzielle Sekretionssignale und zusätzliche Proteine zu berücksichtigen. Dies ergab insgesamt fünf verschiedene Klassen von T1SS und ein konserviertes Motiv wurde in den C-Termini von RTX Toxinen identifiziert. Type I secretion systems (T1SS) are ubiquitous transport machineries in Gram-negative bacteria. The translocon is of a relatively simple assembly and comprises an ABC transporter, a membrane fusion protein (MFP) and a TolC-like outer membrane porin (OMP). While the ABC transporter and the MFP likely form a constantly assembled complex in the inner membrane, the OMP is only recruited upon substrate recognition in the cytosol. The assembled complex mediates the secretion of its dedicated substrate in one step, without periplasmic intermediate, C-terminus first, across both membranes to the extracellular space. The substrates of T1SS are of remarkable variability in terms of size and function, ranging from 5 to more than 800 kDa and display functions as bacteriocins, haemolytic exotoxins, proteases, lipases, iron scavenger proteins or adhesins. Different types of accessory domains on the transporter subunits and accessory domains within the operons are involved in mediating the secretion process. In this thesis, the haemolysin A T1SS from Escherichia coli was studied. The ABC transporter subunit HlyB, which comprises a C39 peptidase-like domain at its N-terminus, was purified, reconstituted in saposin-A nanoparticles and functionally characterised in a detergent-free environment. These studies revealed a strong influence of free detergent micelles on the functional properties of the ABC transporter. Furthermore, the overexpression by fed-batch fermentation of the assembled inner membrane complex, the ABC transporter HlyB and the MFP HlyD, and its subsequent purification were established. Initial structural studies were performed by negative-stain electron microscopy. To reduce impurities and to overall facilitate the overexpression of membrane proteins the new expression strain C41(DE3)∆ompF∆acrAB was developed. The strain was found to increase yield, purity and stability of integral membrane proteins and provided protection from degradation. Finally, this thesis was completed by bioinformatic studies that aimed at classifying the different T1SS and identifying conserved secretion motifs in the substrates. An initial study was solely based on the accessory domains of the cognate ABC transporters and was later on extended to include also operon organisation, potential secretion signals and accessory proteins. This resulted in overall five different classes of T1SS and a conserved motif was identified in the C-termini of RTX toxins.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	20.12.2018
Dateien geändert am:	20.12.2018
Promotionsantrag am:	23.10.2018
Datum der Promotion:	19.11.2018