Dokument: Assay development and optimization for the validation and quantification of NHR2 tetramerization inhibitors and prediction of the binding mode

Titel:	Assay development and optimization for the validation and quantification of NHR2 tetramerization inhibitors and prediction of the binding mode
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=47988
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20181206-114859-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M.Sc. Kröger, Tobias [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,99 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.12.2018 / geändert 05.12.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Gohlke, Holger [Gutachter] Prof. Dr. Groth, Georg [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Die akute myeloische Leukämie ist eine Unterform der Leukämie, die bei erwachsenen Patienten mehr als ein Viertel der Leukämien ausmacht. Diese Krankheit zeichnet sich durch ein schlechtes Behandlungsergebnis, niedrige Remissionsraten, ein kurzes krankheitsfreies Überleben und ein kurzes Gesamtüberleben aus. Bis heute gibt es keine wirksame Behandlung, sodass alle AML-Patienten eine schlimme Prognose haben. Das Fusionsprotein RUNX1/ETO erwies sich als attraktives Ziel für die Entwicklung einer Behandlung. Dieses Protein ist das Ergebnis einer Translokation, die die Chromosomen 8 und 21 betrifft. Es kann in ~ 12% de novo AML Fällen gefunden werden. Die Translokation wurde bereits 1973 entdeckt, und neue Erkenntnisse weisen darauf hin, dass es sich um das initiative Ereignis für akute myeloische Leukämie handelt. RUNX1/ETO ist als Homotetramer aktiv und enthält die α-helikale Oligomerisierungsdomäne nervy homology region 2 (NHR2), die sich für die Tetramerisierung als entscheidend erwiesen hat. Es wurden Strategien entwickelt, die darauf abzielten, kleine Moleküle zu identifizieren, die die Tetramerisierung von NHR2 inhibieren können. Mit experimentellen und computergestützten Methoden wurden die Hotspots identifiziert, Aminosäuren, die einen Großteil der freien Bindungsenergie tragen und somit essentiell für die Protein-Protein-Interaktion sind. In nachfolgenden Studien wurde der erste Inhibitor der NHR2-Tetramerisierung identifiziert: 7.44. Studien haben gezeigt, dass 7.44 spezifisch mit NHR2 wechselwirkt und in der Lage ist, die Tetramerisierung von NHR2 im Zellkultur- und im Mausmodell zu verhindern. Das Ziel dieser Arbeit war die Bestimmung der Stabilität des NHR2-Tetramers, der Affinität von 7.44 zu NHR2 und deren Bindemodus. Zuerst zeigte ich die Bildung von Aggregaten durch EDTA und die Wechselwirkung dieser Aggregate mit SYPRO Orange, während ich die Assays für die nachfolgenden Experimente entwickelte. MD-Simulationen lieferten ein molekulares Modell der Aggregation und der Interaktion. Diese SYPRO Orange/EDTA-Wechselwirkung hat weitreichende Konsequenzen, da EDTA und das Thermal Shift Assay weit verbreitet sind. Zweitens habe ich Ktet für das NHR2-Tetramer und Klig für 7.44 vom NHR2-Dimer mit Mircoscale Thermophorese bestimmt. Diese Ergebnisse bezüglich der Stabilität des Tetramers und der Affinität des Liganden liefern neue Informationen, die als Referenz für potentielle Inhibitoren und die Optimierung dieser kleinen Moleküle dienen können. Drittens wurde die Bindungspose von 7.44 unter Verwendung der STD-NMR bestimmt. Diese Experimente enthüllten die Teile von 7.44, die bei einer Wechselwirkung NHR2 am nächsten kommen. Diese Information kann für eine effizientere Suche nach neuen potentiellen Inhibitoren der NHR2-Tetramerisierung verwendet werden. Viertens, unter Verwendung von MD-Simulationen konnte ein molekulares Bild der Interaktion zwischen 7.44 und NHR2 geliefert und eine Vorhersage der Bindestelle des Inhibitors der NHR2 Tetramerisierung erstellt werden. Acute myeloid leukemia is a subform of leukemia that accounts for more than a quarter of leukemias in adult patients. This disease is characterized by a poor treatment outcome, low remission rates, short disease-free survival and short overall survival. To this day, there is no efficient treatment available, leaving all patients of AML with a dire prognosis. The fusion protein RUNX1/ETO emerged as an attractive target for the development of a treatment. This protein is the result of a translocation involving chromosomes 8 and 21. It can be found in ~ 12% of de novo AML cases. The translocation was already discovered in 1973, and, to this day, new insights suggest that it is the initiative event for acute myeloid leukemia. RUNX1/ETO is active as a homotetramer and contains the α-helical oligomerization domain nervy homology region 2 (NHR2), which has been proven crucial for the tetramerization. Strategies arose that focused on identifying small molecules that are able to inhibit the tetramerization of NHR2. Using experimental and computational methods, hot spots, amino acids that contribute the majority of the binding free energy and thus are essential for the protein-protein interaction, were identified. In subsequent studies, the first inhibitor of NHR2 tetramerization was identified: 7.44. Studies have shown that 7.44 specifically interacts with NHR2 and is able to prevent the tetramerization of NHR2 in cell cultures and a mouse model. The aim of this thesis was to determine the stability of the NHR2 tetramer, the affinity of 7.44 towards NHR2 and their binding mode. First, I showed the formation of aggregates by EDTA and the interaction of these aggregates with SYPRO Orange while setting up the assays for the subsequent experiments. MD simulations provided a molecular model of the aggregation and the interaction. This SYPRO Orange/EDTA interaction has widespread consequences, since EDTA and the thermal shift assay are widely used. Second, I determined the Ktet for the NHR2 tetramer and the Klig for 7.44 using microscale thermophoresis. These results regarding the stability of the tetramer and the affinity of the ligand provide new information that will serve as a reference point for other potential inhibitors and the optimization of these small molecules. Third, the binding pose of 7.44 was determined using STD-NMR. These experiments revealed the moieties of 7.44 that come closest to NHR2 upon interaction. This information can be used for a more efficient search for new potential inhibitors of the NHR2 tetramerization. Fourth, using MD simulations a molecular image of the interaction between 7.44 and NHR2 was provided and the binding site of the NHR2 tetramerization inhibitor was predicted.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Pharmazie » Pharmazeutische und Medizinische Chemie
Dokument erstellt am:	06.12.2018
Dateien geändert am:	06.12.2018
Promotionsantrag am:	10.10.2018
Datum der Promotion:	31.10.2018