| Beschreibungen: | Die CLC-Familie der Chlorid Kanäle und Transporter ist eine große und diverse Gruppe, die aus neun Mitgliedern besteht, die von Säugerzellen exprimiert werden. Cl- /H+ Austauscher haben mehrere unterschiedliche Funktionen, sowohl in der Plasmamembran, als auch in intrazellulären Kompartimenten. In der vorliegenden Studie fokussieren wir uns auf eine Untergruppe der CLC-Familie. Im Besonderen gilt dabei unserer Interesse den zwei sehr strukturhnlichen Mitgliedern ClC-3 und ClC-5. Die physiologische Bedeutung von ClC-3 in Zentralen Nervensystem wurde durch das knock-out Tiermodell Clcn3-/- nachgewiesen. ClC-3 defiziente Mäuse wiesen eine starke hippokampale und retinale Degeneration auf, die zwei Wochen nach der Geburt in der CA1 Region des Hippokampus begann. Veränderungen bei der synaptischen neuronalen Übertragung lassen vermuten, dass ClC-3 eine modulatorische Rolle sowohl bei der exzitatorischen, als auch bei der inhibitorischen Nervenübertragung spielt. Neben seiner Rolle bei der Nervenübertragung, wird seit kurzem vermutet, dass ClC-3 auch eine regülatorische Rolle im Neuroendokrinen System spielt, auch wenn seine mögliche Rolle bei der Exozytose noch debattiert wird. Das Ziel dieser Studie ist, die Charakterisierung der Rolle von ClC-3 bei der Regulation der Exozytose von großen synaptischen Vesikeln (large dense core vesicles, LDCVs) in neuroendokrinen Zellen. Daher untersuchen wir die Exozytose in adrenalen Chromaffin Zellen mit Hilfe einer kombinierten Technik aus Membrankapazitäts- und amperometrischer Messung. Vorherige Ergebnisse zeigen, dass die Exozytose in Chromaffin Zellen in adulten Clcn3-/- Mäusen ernsthaft beeinträchtigt ist (70% Reduktion). Daher untersuchten wir ebenfalls Clcn3-/- Mäuse mit Hilfe der Membrankapazitäts- und amperometrischen Messungen, und obwohl wir eine ähnliche Beeinträchtigung der Exozytose bei erwachsenen Mäusen nachwiesen, beobachteten wir keinen signifikanten Effekt bei neugeborenen Mäusen ohne ClC-3. Daher untersuchten wir ob ein anderer Chlorid/Protonen Austauscher, mit ähnlichen funktionellen Eigenschaften wie ClC-3, möglicherweise in der Lage ist den Verlust von ClC-3 in frühen Entwicklungsstadien (P0) zu kompensieren. Ein vielversprechender Kandidat dafür ist ClC-5. Quantitative Real-time PCR hat gezeigt, dass ClC-5 weniger häufig ist, in adrenalen Drusen aus erwachsenen Mäusen. Um den Beitrag von ClC-5 an der Exozytose zu testen, dämpften wir die Expression von ClC-5 (mit Hilfe der shRNA knock-down Technik) in isolierten Chromaffin Zellen aus neugeborenen Clcn3-/- Mäusen. Die Exozytose in solchen Doppel knock-out Mutanten (DBKOs) war, ähnlich wie bei der beeinträchtigten Exozytose bei erwachsenen ClCn3 Mäusen, signifikant verringert. Außerdem zeigte die Analyse von amperometrischen Einzelereignissen keinen Unterschied zwischen DBKO und WT Zellen, was daraufhin deutet, dass weder ClC-3 noch ClC-5 eine Rolle bei der Neurotransmitterbeladung von LDCVs spielen. Verblüffenderweise deutet eine verringerte Frequenz der amperometrischen Spikes, die wir bei diesen Experimenten in erwachsenen Clcn3-/- beobachteten auf eine verringerte Fusionsfrequenz von LDCVs hin, und weist auf eine geringere Anzhal von vorbereiteten Vesikeln hin. Um diese Hypothese zu bestätigen, kontrollierten wir die Erhöhung der Membrankapazität, über ein depolarisierendes Spannungsprotokoll, um den Vesikel- Vorbereitungsprozess aufzuklären. Bei DBKOs beobachteten wir eine verringerte Anzahl von Vesikeln, die in einen fusionskompetenten Status übergehen konnten, was daraufhin deutet, dass ClC-3 und ClC-5 die Vesikel-Mobilisierung kontrollieren. Es konnte zum ersten Mal die Rolle von ClC-5 in der LDCV Exozytose gezeigt werden. Schließlich kombinierten wir die konfokale Laserscan Mikroskopie und immunohistochemische Experimente um unsere Hypothese der möglichen Beteilung der CLCs an der Neurosekretion, über die subzelluläre Verteilung von ClC-3 und ClC-5 zu bestätigen.The CLC family of chloride channels and transporters is a large and diverse group, which comprises nine members expressed in mammalian cells. Cl- /H+ exchangers fulfill several diverse functions, either at the plasma membrane or in intracellular compartments. In this present study we focus on a sub-branch of the CLC family, with particular interest towards two highly similar members: ClC-3 and ClC-5. The physiological relevance of ClC-3 in the central nervous system (CNS) became evident when the Clcn3-/- knock-out animal model was generated. ClC-3-deficient mice showed pronounced hippocampal and retinal degeneration, starting in the CA1 region of the hippocampus two weeks after birth. Alterations in synaptic neuronal transmission suggest that ClC-3 might play a modulatory role in both excitatory as well as inhibitory neurotransmission. Beside its role in neuronal transmission, ClC-3 was more recently proposed as regulator in the neuroendocrinal system, even though its possible role in exocytosis is still under debate. The aim of this project is to characterize the role of ClC-3 in regulated exocytosis of large dense core vesicles (LDCVs) in neuroendocrinal cells. Thus, we elucidated exocytosis in adrenal chromaffin cells through a combined technique of cell membrane capacitance and amperometric recordings. According to previous results, exocytosis in adult Clcn3-/- chromaffin cells (P60) is severely affected (70% reduction). We therefore performed amperometric and membrane capacitance measurements in such adult Clcn3-/- mice and even though we could detect a similar impairment in exocytosis, we could not observe any significant effect in new born mice lacking of ClC-3. Thus, we investigated whether another chloride/proton exchanger, which share similar functions to those performed by ClC-3, might compensate for the absence of ClC-3 in early developmental stages (P0). A promising candidate appears to be ClC-5. Quantitative real-time PCR experiments indeed prove that ClC-5 is less abundant (down-regulated) in adrenal glands extracted from adult mice. Intriguingly, ClC-5 was up-regulated in absence of ClC-3 in new born mice, suggesting that it might be compensating for it. To test the effect of ClC-5 in exocytosis, we therefore silenced ClC-5 (via shRNA knock-down strategy) in chromaffin cells isolated from Clcn3-/- new born mice. Exocytosis in such double knockout chromaffin cells was significantly decreased, similarly to the impairment observed in exocytosis measured in Clcn3-/- adult mice. Moreover, analysis of single amperometric events did not reveal any difference between DKOs and WT cells, indicating that most probably ClC-3 and ClC-5 do not regulate neurotransmitter loading in LDCVs. Intriguingly, the reduced amperometric spike frequency observed in Clcn3-/- adult mice and double KOs new-born mice reflect a decreased LDCV fusion frequency, which suggests a reduced number of primed vesicles. To confirm this hypothesis, we therefore monitored membrane capacitance increase by applying a depolarizing voltage protocol, in order to elucidate the vesicle priming process. In the DKOs we observed a strong reduction in the number of vesicle which are able to reach a fusion-competent state, which indicates that ClC-3 and ClC-5 are able to control vesicle mobilization during neurosecretion. Taken together, our results indicate that ClC-3 and ClC-5 can govern vesicle priming and show for the first time the implication of ClC-5 in LDCV exocytosis. Finally, in order to confirm our hypothesis, we combined laser scan confocal microscopy and immunocytochemistry experiments to prove the substantial comparable subcellular distribution of ClC-3 and ClC-5 and therefore their essential mutual role in neurosecretion.
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