Dokument: Analyse kardialer mitochondrialer Proteinphosphorylierungen in Akt1 und Akt2 KO Mäusen

Titel:	Analyse kardialer mitochondrialer Proteinphosphorylierungen in Akt1 und Akt2 KO Mäusen
Weiterer Titel:	Analysis of the cardiac mitochondrial phosphoproteome in Akt1 and Akt2 KO mice
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=47854
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20181115-104852-9
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Lachmann, Eva Stella [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,43 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 15.11.2018 / geändert 15.11.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Gödecke Axel [Gutachter] Prof. Dr. Haendeler, Judith [Gutachter] [im Online-Personal- und -Vorlesungsverzeichnis LSF anzeigen]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Die Proteinkinase B (Akt) beeinflusst diverse Signaltransduktionen am Herzen. Es werden am Herzen zwei unterschiedliche Isoformen- Akt1 und Akt2- exprimiert. Nach Aktivierung über den PI3K-Signalweg, transloziert die aktivierte Akt u.a. in die Mitochondrien, in denen zahlreiche Substrate phosphoryliert werden. In dieser Arbeit wurden erstmalig die Akt-isoformspezifischen und -unspezifischen Effekte auf das kardiale mitochondriale Phosphoproteom analysiert. Die Untersuchungen wurden an induzierbaren Akt1 bzw. Akt2 Knock Out Mäusen durchgeführt, die den Gendefekt spezifisch in Kardiomyozyten aufweisen. Veränderungen im Phosphoproteinmuster wurden mittels Massenspektrometrie analysiert. Die Akt1 und Akt2 KO Mäuse wurden unter basalen Bedingungen und nach Insulinstimulation untersucht. Die Mitochondrien wurden mittels eines Antikörper-basierten magnetischen Auftrennverfahrens isoliert. Die Anreicherung und Reinheit der mitochondrialen Fraktionen wurden mittels Western Blot Analysen kontrolliert. Die angereicherten Mitochondrien wurden im Anschluss einer dreifachen Formaldehydmarkierung unterzogen, die die Identifizierung und relative Quantifizierung der phosphorylierten Peptide in der Nano-LC-ESI-MS/MS-Analyse ermöglichte. Die Analyse des mitochondrialen Phosphoproteoms führte zur Identifizierung von 132 nichtredundanten Phosphopeptiden, 94 korrespondierenden distinkten Proteinen sowie 25 neuen Phosphorylierungsstellen. Nach Insulinstimulation konnten 190 Phosphopeptide mit 121 Proteinen und 46 neue Phosphorylierungsstellen detektiert werden. Es wurden Phosphoproteine in sämtlichen mitochondrialen Funktionsklassen und Kompartimenten detektiert, wobei Insulin die Anzahl und Diversität an Phosphopeptiden, Phosphoproteinen und Phosphorylierungsstellen wesentlich steigert. Es wurden insgesamt 17 Kandidaten identifiziert, die hochwahrscheinlich einer Akt-isoformspezifischen und –unspezifischen Regulation unterliegen: 4 Kandidaten unter basalen Bedingungen und 13 Substrate nach Insulinstimulation. Die meisten Proteine, die einer insulinvermittelten, Akt-abhängigen Regulation unterliegen, können dem Metabolismus und der oxidativen Phosphorylierung zugeordnet werden. Diese Ergebnisse suggerieren, dass mitochondriales Akt über Phosphorylierungsmechanismen eine essentielle Rolle in der Orchestrierung von Substrat- und Sauerstoffbedarf und Energieproduktion am Herzen spielt. In dieser Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass auch die -Untereinheit der ATP-Synthase nach Insulinstimulation einer Akt-abhängigen Phosphorylierung unterliegt. Schlussfolgerung: Die zahlreichen neuen Informationen zur Phosphorylierung mitochondrialer Proteine tragen zu einem besseren Gesamtverständnis des kardialen mitochondrialen Phosphoproteoms und Akt-isoformabhängiger Effekte auf mitochondriale Signalnetzwerke am Herzen bei. The protein kinase Akt is a pivotal kinase in the heart and is a central mediator of cardiac metabolism, growth, hypertrophy, survival and apoptosis. In the heart, two isoforms are expressed, Akt1 and Akt2, which may exert specific functions in signal transduction. Akt is acivated by the PI3K-pathway, which is initiated by various types of stimuli, like insulin. The full activation of Akt mediates its translocation to the mitochondrion and subsequent phosphorylation of numerous substrates. To analyze the Akt1 and Akt2 isoform-specific signaling in the heart we have generated conditional KO mice allowing inducible deletion of Akt1 and Akt2 isoforms in cardiomyocytes of the adult heart (iCMAkt KO). In order to uncover mitochondrial functions of Akt, we investigated the cardiac mitochondrial phosphoproteome of wild type (WT), iCMAkt1 KO and iCMAkt2 KO mice and searched for Akt targets. Mice were analysed under basal conditions or stimulation of Akt signaling by insulin. Mitochondria were isolated from mouse hearts by an antibody-based separation via magnetic beads. We validated the enrichment and purity of the mitochondrial fractions by Western Blot, using antibodies specific for different cellular compartments. The enriched mitochondria were subjected to stable isotope dimethyl labeling, enrichment of phosphopeptides and subsequent identification and quantification of phosphorylated peptides by mass spectrometry. Analysis of the mitochondrial phosphoproteome led to the identification of 132 nonredundant phosphopeptides corresponding to 94 distinct mitochondrial proteins. Among these, 25 phosphosites were newly discovered. After insulin stimulation, 190 mitochondrial phosphopeptides corresponding to 121 phosphoproteins and 46 new phosphosites were found. Phosphoproteins were located in all submitochondrial compartments and were associated with all mitochondrial functions. Insulin increases the phosphorylation of mitochondrial proteins. In total, 17 mitochondrial proteins appeared to be differentially phosphorylated in Akt KO mice: 4 proteins under basal conditions and 13 proteins after insulin stimulation. Among these proteins, the majority is involved in mitochondrial metabolism and oxidative phosphorylation. The α-subunit of ATP-synthase was a prominent target for phosphorylation in an Akt dependent manner. These results suggest a regulatory role of Akt in ATP synthesis. Conclusion: Mitochondrial proteins are modified substantially by phosphorylation. The new results contribute to a deeper understanding of the cardiac mitochondrial phosphoproteome and Akt dependent effects on mitochondrial signaling in the heart.
Rechtliche Vermerke:	Promotionsordnung vom 08.02.2017
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Bezug:	2018
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	15.11.2018
Dateien geändert am:	15.11.2018
Datum der Promotion:	13.11.2018