Dokument: Mechanisms Underlying Biphasic Synaptic Vesicle Acidification in Glutamatergic Synapses

Titel:	Mechanisms Underlying Biphasic Synaptic Vesicle Acidification in Glutamatergic Synapses
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=47602
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20181022-102010-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Beinlich, Felix Ralf Michael [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 3,75 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.10.2018 / geändert 18.10.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Fahlke, Christoph [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 530 Physik
Beschreibungen:	Signalübertragung und Informationsverarbeitung einer chemischen Synapse während neuronaler Aktivität beruht auf der regulierten Freisetzung von Neurotransmittern. Diese Art der chemischen Erregungstransmission basiert auf der repetitiven Fusion von synaptischen Vesikeln mit der Plasmamembran. Um die Verfügbarkeit beladener synaptischer Vesikel zu gewährleisten, werden diese durch Recycling regeneriert. Dieser Prozess beinhaltet Endozytose, Neurotransmitterbeladung und Exozytose. Da die Anzahl der freigesetzten Neurotransmittermoleküle direkt die Stärke der synaptischen Transmission moduliert, ist deren Beladung der kritischste Schritt während des Recycling. Obgleich mehrere Mechanismen und regulatorische Prozesse bereits identifiziert wurden ist die Regulation des Grades der Vesikelbeladung noch nicht vollständig verstanden. Der wichtigste exzitatorische Neurotransmitter im Nervensystem der Wirbeltiere ist Glutamat. Vesikuläre Glutamattransporter nutzen den protonenelektrochemischen Gradienten als treibende Kraft für die Glutamatakkumulation in synaptische Vesikel. Die vesikulare Glutamataufnahme wird darüber hinaus durch niedrige millimolare [Cl-]Cytosol stimuliert und durch hohe millimolare [Cl-]Cytosol inhibiert. Abwesenheit des Cl-/H+ Austauscher ClC-3 führt zu schwerwiegender Degeneration des zentralen Nervensystems. Die genaue Funktion von ClC-3 in der Regulation der Glutamatbeladung ist noch nicht vollständig untersucht und wird gegenwärtig diskutiert. In dieser Thesis konnte mittels des fluoreszierenden Proteins Cerulean, als neuartiger Biosensor und Fluoreszenzlebenszeitmikroskopie, der absolute pH Wert in synaptischen Vesikeln von kultivierten Primärneuronen des Hippocampus bestimmt werden. Es wurde gezeigt, dass nach der Endocytose synaptische Vesikel erst bis zu pH 4.5 ansäuern und dann wieder auf den Ruhe pH alkalisiert. Mittels knock-out Mausmodellen und pharmakologischen Blockern konnte der molekulare Prozess hinter diesem biphasischem Prozess der Ansäuerung aufgeklärt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die anfängliche Ansäuerung des synaptischen Vesikels unabhängig von der V-ATPase Aktivität, aber in Abhängigkeit der luminalen [Cl-] stattfindet. Die luminale [Cl-] ist anfangs im Vergleich zur [Cl-]Cytosol hoch. Der dadurch entstehende ΔCl- wird genutzt durch den Cl-/H+ Austauscher ClC-3, um luminales Cl- gegen cytosolische H+ auszutauschen. Dies führt zu einer bisher unbekannten, ATP unabhängigen, Ansäuerung des synaptischen Vesikels. Der dadurch entstehende protonenelektrochemische Gradient wird dann von VGLUT1 genutzt, um Glutamat im synaptischen Vesikel zu akkumulieren. Es konnte weiterhin gezeigt werden, dass die Alkalisierung abhängig ist von VGLUT Aktivität. Die Ergebnisse dieser Arbeit liefern einen neuen Einblick in die Bedeutung des Cl-/H+ Austauschers ClC-3 in der Regulation des pHSV. During neuronal activity signal transmission and information processing at a chemical synapse relies on the regulated release of neurotransmitters which are stored in synaptic vesicles. This type of chemical neurotransmission is based on the repetitive fusion of a high number of synaptic vesicles with the plasma membrane. In order to refill the pool of neurotransmitter-loaded synaptic vesicles they are regenerated by recycling. This process involves endocytosis, neurotransmitter loading and exocytosis of synaptic vesicles. Because the amount of neurotransmitter molecules stored in synaptic vesicles directly modulates the strength of synaptic transmission the filling of synaptic vesicles with neurotransmitters is the most critical step in synaptic vesicle recycling. The regulation of the degree of vesicle filling is not fully understood yet, although several mechanisms and regulatory processes have been identified already. The major excitatory neurotransmitter in the vertebrate nervous system is glutamate. Glutamate uptake into synaptic vesicles is mediated by vesicular glutamate transporters (VGLUTs) that utilize the electrochemical gradient of protons for vesicular glutamate accumulation. Moreover, vesicular glutamate uptake is stimulated by low millimolar [Cl-]cytosol and inhibited by high millimolar [Cl-]cytosol. Removal of the Cl-/H+ exchanger ClC-3 leads to severe neurodegeneration. The exact function of ClC-3 in regulation of glutamate uptake is not fully understood yet and controversially discussed. By use of the fluorescent protein Cerulean as a novel biosensor for pH-sensing and fluorescence lifetime imaging microscopy the absolute pH in synaptic vesicles in primary hippocampal neurons could be measured. It is shown for the first time that after endocytosis synaptic vesicle first over-acidify to a pH similar to that of lysosomes, and then alkalize to the resting pH. By a combination of knock-out mice models and pharmacological blocking the molecular process behind this biphasic acidification process could have been unraveled. The initial acidification is independent of V-ATPase activity but strongly depends on the luminal Cl- concentration. It could be demonstrated for the first time that the initial ΔCl- with high luminal Cl- concentration is utilized by the Cl-/H+ exchanger ClC-3 to rapidly accumulate cytosolic H+ in exchange to luminal Cl- in the synaptic vesicle lumen. This, hitherto unknown process of acidification mediated by Cl-3 enlightens an ATP-independent, energy saving pathway of synaptic vesicle acidification promoting the exhibition of the driving force which regulates neurotransmitter loading in recycled synaptic vesicles. The re-alkalization process, furthermore, is mediated by VGLUT1 activity. The findings in this thesis thus provide a new insight into the importance of the luminal [Cl-] and the Cl-/H+ exchanger ClC-3 in the regulation of pHSV after endocytosis of recycled synaptic vesicles.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	22.10.2018
Dateien geändert am:	22.10.2018
Promotionsantrag am:	13.06.2018
Datum der Promotion:	12.10.2018