Dokument: High-resolution genome and transcriptome analysis of Gluconobacter oxydans 621H and growth-improved strains by next-generation sequencing

Titel:	High-resolution genome and transcriptome analysis of Gluconobacter oxydans 621H and growth-improved strains by next-generation sequencing
Weiterer Titel:	Hochauflösende Genom- und Transkriptomanalysen von Gluconobacter oxydans 621H und Stämmen mit erhöhter Biomasseausbeute mittels Next Generation Sequencing
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=47408
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20181018-105356-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kranz, Angela [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 11,78 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.10.2018 / geändert 08.10.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Bott, Michael [Gutachter] Jun.-Prof. Dr. Axmann, Ilka M. [Gutachter]
Stichwörter:	Gluconobacter oxydans, next generation sequencing, microbiology
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The acetic acid bacterium Gluconobacter oxydans is an important organism used in industrial biotechnology. It is characterized by its exceptional ability to regio- and stereoselectively oxidize a broad range of substrates in the periplasm. However, a disadvantage of this bacterium is the low final biomass yield on sugar-containing complex media. Recently, metabolic engineering allowed construction of strain IK003.1 with a 60% increased biomass yield on glucose. Modifying metabolism in such a way may affect the genome stability and may cause suppressor mutations. Therefore, one aim of this thesis was the use of next-generation and nanopore sequencing to sequence the genomes of engineered and reference strains in order to detect mutations. Except for the introduced genetic alterations and one mobile element insertion, no further mutations were found in strain IK003.1 in comparison to the reference strains. This suggests that the constructed strain is quite stable and therefore well suited for further metabolic engineering efforts. Furthermore, the new sequencing results were used to update the reference genome sequence of G. oxydans 621H. The second part of this thesis dealt with comprehensive RNAseq analysis to characterize the transcriptional landscapes of G. oxydans. This resulted in the detection of 2,449 transcription start sites (TSSs) and allowed to define the -10 region “nATnnn” and the -35 region “ttGnnn” as promoter consensus sequences. Analysis of 5´-UTRs also showed that 5% of all transcripts with an identified TSS are leaderless and 43% are longer than 100 nt. Furthermore, 971 potential novel transcripts were identified. 1,144 genes (41%) were found to be expressed monocistronically, whereas 1,634 genes (59%) belonged to 571 operons. Also, TSSs within operons indicated expression of 720 genes in 341 sub-operons. The stability of mRNAs plays an important role in the post-transcriptional regulation of gene expression and can influence the production rate of proteins and growth of bacteria. Using DNA microarrays, we determined mRNA half-lives for 2,500 genes (95%) and analysed them based on a functional categorization. Furthermore, we observed instability of the 23S rRNA. Next-generation sequencing of rRNA isolated from enriched ribosomes revealed a distinct fragmentation pattern and indicated the presence of three fragmentation positions in three 23S rRNAs and four fragmentation positions in one 23S rRNA of G. oxydans. Das Essigsäurebakterium Gluconobacter oxydans ist ein wichtiger Organismus für die industrielle Biotechnologie. Es zeichnet sich besonders durch die Fähigkeit aus, ein breites Spektrum an Substraten im Periplasma regio- und stereoselektiv oxidieren zu können. Ein Nachteil dieses Bakteriums ist allerdings die geringe Biomasse-Ausbeute auf zuckerhaltigen Komplexmedien. In jüngster Zeit erlaubte Metabolic Engineering die Konstruktion des Stammes IK003.1, der eine um 60% gesteigerte Biomasse-Ausbeute auf Glucose-haltigem Medium zeigt. Solche Veränderungen im Metabolismus können die Genomstabilität beeinflussen und Suppressor-Mutationen hervorrufen. Ein Ziel dieser Arbeit war daher die Genom-Sequenzierung der konstruierten Stämme sowie von Referenz-Stämmen unter Verwendung von Next-Generation- und Nanopore-Sequenzierung, um Mutationen zu detektieren. Abgesehen von den eingeführten genetischen Veränderungen sowie einer strukturellen Variante verursacht durch ein mobiles genetisches Element, wurden keine zusätzlichen Mutationen im Stamm IK003.1 im Vergleich zu den Referenzstämmen gefunden. Dies weist darauf hin, dass der konstruierte Stamm ziemlich stabil ist und daher gut für weitere Stammentwicklungen geeignet ist. Weiterhin resultierten die Ergebnisse der Sequenzierungen in einer Aktualisierung der Referenzsequenz von G. oxydans 621H. Der zweite Teil dieser Arbeit umfasste ausführliche RNA-Seq Analysen, um die transkriptionelle Landschaft von G. oxydans zu charakterisieren. Dies führte zu der Detektion von 2449 Transkriptionsstartpunkten (TSSs) und erlaubte die Definierung der -10 Region „nAtnnn“ und der -35 Region „ttGnnn“ als Promoter-Konsensusmotiv. Analyse der 5´-untranslatierten Regionen (5´-UTRs) zeigte außerdem, dass 5% aller Transkripte mit einem identifizierten TSS leaderless sind und dass 43% länger als 100 nt sind. Außerdem wurden 971 neue Transkripte identifiziert. 1144 Gene (41%) sind als Einzelgene exprimiert, während 1634 Gene (59%) 571 Operons zugeordnet werden konnten. TSSs innerhalb von Operons deuteten weiterhin auf die Expression von 720 Genen in 341 Sub-Operons hin. Die Stabilität von mRNAs spielt eine große Rolle für die post-transkriptionelle Regulation von Genexpression und kann daher Einfluss auf die Produktionsrate von Proteinen und auf das Wachstum von Bakterien nehmen. Mittels DNA Microarrays konnten mRNA Halbwertszeiten für 2500 Gene (95%) bestimmt und hinsichtlich ihrer funktionellen Kategorisierung analysiert werden. Außerdem wurde eine Instabilität der 23S rRNA beobachtet. Next Generation Sequencing der aus angereicherten Ribosomen isolierten rRNA zeigte ein ausgeprägtes Fragmentierungsmuster und deutete die Anwesenheit von drei Fragmentierungspositionen in drei 23S rRNAs und vier Fragmentierungspositionen in einer 23S rRNA von G. oxydans an.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	18.10.2018
Dateien geändert am:	18.10.2018
Promotionsantrag am:	04.10.2017
Datum der Promotion:	26.02.2018