Dokument: Untersuchungen zur Suszeptibilität von Stamm- und Progenitorzellen, Endothelzellen und glatten Muskelzellen gegenüber genotoxischen Noxen

Titel:	Untersuchungen zur Suszeptibilität von Stamm- und Progenitorzellen, Endothelzellen und glatten Muskelzellen gegenüber genotoxischen Noxen
Weiterer Titel:	Analysis of the susceptibility of mouse embryonic stemcells, endothelial cells and smooth muscle cells against genotoxic noxa
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=47110
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180927-102717-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Diplom Biologin Hennicke, Tatiana [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 34,22 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 14.09.2018 / geändert 14.09.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Fritz, Gerhard [Gutachter] Prof. Dr. Rüther, Ulrich [Gutachter]
Stichwörter:	Stammzellen Endothelzellen Doxorubicin ionisierende Strahlung Kardiotoxizität DNA-Schadensantwort DNA-Reparatur
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Endothelzellen und glatte Muskelzellen, welche das Innere von Blutgefäße auskleiden, agieren als eine selektive Barriere zwischen dem Lumen der Blutgefäße und dem sie umgebenden Gewebe. Aufgrund dieser Barrierefunktion werden die Zellen der Blutgefäße einer sehr hohen Konzentration an systemisch präsenten Noxen ausgesetzt. Daher ist es denkbar, dass das vaskuläre Endothelium effektive Reparatur- und Regenerationsprozesse bereitstellen muss, um die vaskuläre Gesundheit sicherzustellen. Falsche oder unvollständige Reparatur von Schäden resultiert in pathophysiologischen Veränderungen und manifestiert eine endotheliale Dysfunktion. Herz-Kreislauf-Erkrankungen zählen in Deutschland und anderen Industrienationen zu den häufigsten Todesursachen. Dysfunktionen in den Zellbestandteilen der Blutgefäße können beispielsweise zu Herzinsuffizienz oder Arteriosklerose führen. Neben den bekannten Risikofaktoren können auch bestimmte Umweltgifte das Risiko zur Entstehung solcher Krankheiten erhöhen. Auch Medikamente, wie sie beispielsweise in der Tumortherapie eingesetzt werden, führen zu unerwünschten Nebenwirkungen, wie u.a. Kardiotoxizität. Neben einer direkten Schädigung der Zellen der Blutgefäße durch Genotoxine, könnte auch der Einfluss auf den endogenen Stammzellpool eine Rolle spielen. Vaskuläre Stamm-und Progenitorzellen tragen maßgeblich zur Regeneration der Blutgefäße bei. Eine Akkumulation von DNA-Schäden in Progenitorzellen oder eine Erschöpfung des Stammzellpools kann eine entscheidende Ursache für das Entstehen von vaskulären Krankheiten sein. Die molekularen Mechanismen, die zu solchen endothelialen Dysfunktion führen und welcher Zelltyp der Blutgefäße am stärksten durch Genotoxine beeinträchtig wird, ist nicht genau geklärt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein in vitro Testsystem entwickelt mit dem sich die molekularen Auswirkungen von Genotoxinen (am Besispiel von ionisierender Strahlung und Doxorubicin) auf die Zellen der Blutgefäße (Endothelzellen und glatte Muskelzellen), sowie auf das regenerative Potential von Progenitorzellen untersuchen lassen. Der Fokus lag auf der Analyse der resultierenden DNA-Schadensantwort und der Reparaturfähigkeit der Zellen. Zu diesem Zweck wurden zunächst Protokolle entwickelt, mit denen sich die embryonale Stammzelllinie LF2 der Maus (mESC) in funktionsfähige Endothelzellen (EC) und glatte Muskelzellen (SMC) differenzieren lässt. Die in dieser Arbeit differenzierten Zellen exprimierten nicht nur zelltypspezifische Markergene, sondern besaßen prototypischen zelltypspezifische Funktionen. Vergleichende Genexpressionsanalysen von Suszeptibilitätsfaktoren, welche in die DNA-Reparatur, die Zellzyklusregulation und den Zelltod involviert sind, zeigten deutliche Unterschiede in der basalen und Genotoxin-induzierten Expression, zwischen mESC, EC und SMC. Die Expression von Genen, die an den verschiedenen DNA-Reparaturmechanismen (HR, NHEJ, BER, MMR und NER) beteiligt sind, war in den mESC deutlich verstärkt. SMC zeigten die geringste basale Expression von Reparaturgenen, welche auch nicht durch Bestrahlung (IR) oder Behandlung mit Doxorubicin induziert werden konnte. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Expression von an der Apoptose beteiligten Genen (c-Iap1, Fas-R, Bax, Bid) in mESC und EC im Vergleich zu SMC deutlich erhöht war. In Einklang zu diesen Daten, zeigten Untersuchungen zur Reparatur von DNA-Doppelstrangbrüchen, dass mESC und EC diese Schäden mit einer größeren Effizienz reparieren als SMC. Außerdem leiten mESC und EC, trotz der besseren Fähigkeit zur DNA-Reparatur, verstärkt den programmierten Zelltod ein. Weiterhin wurde in dieser Arbeit der Einfluss von Genotoxinen auf das Differenzierungspotential von Progenitorzellen in funktionsfähige EC und SMC analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass selbst hohe Dosen IR eine Differenzierung der Zellen nicht verhinderten, wohingegen vergleichbar zytotoxische Dosen Doxorubicin zu einem Verlust des Differenzierungspotentials in funktional kompetente EC und SMC führten. Die Ergebnisse der Untersuchungen dieser Arbeit machen das Potential von auf mESC basierenden in vitro Differenzierungssystemen für (i) toxikologische Arzneimittelbewertungen und für (ii) die gründliche Charakterisierung von Einflüssen der DNA-Reparatur und der DNA-Schadensantwort auf die Angiogenese und die vaskuläre Funktionalität unter chronischen umweltbedingten Stresssituationen deutlich. Endothelial cells and smooth muscle cells line the entire of blood vessels, thereby acting as a semi-selective barrier between the vessel lumen and the surrounding tissue. Due to their barrier function endothelial cells and also smooth muscle cells are exposed to high concentrations of systemically present noxae. Therefore it is conceivable that the vascular endothelium has to ensure distinct damage defense and regenerative mechanisms to guarantee vascular health. Incorrect repair of damage and incomplete regeneration eventually ends up in pathophysiological alterations, which manifest as endothelial dysfunction. Cardiovascular diseases are the most frequent cause of death in industry nations. Dysfunctions in the constituent parts of blood vessels might lead to cardiac insufficiency, coronary heart disease, heart attack, hypertension or arteriosclerosis. Beside the known risks like increased cholesterol levels, alcohol abuse, smoking, stress and physical inactivity also certain environmental pollutant can raise the risk for cardiovascular diseases. Drugs that are used in the treatment of cancers lead to side effects like cardiotoxicity, too. Also irradiation dependent vessel transformations are considered to be a cause of cardiovascular diseases and influence the regenerative potential of blood vessels. Beside direct impairments of blood vessel cells through genotoxins, the effect on endogenous stem and progenitor cells plays a crucial role in the impairment of blood vessels. An accumulation of DNA-damage in progenitorcells or a depletion of the stem cell pool might be an essential reason for the development of vascular diseases. The molecular mechanisms which lead to such endothelial and vascular dysfunctions and which cell type of the blood vessel is mostly effected, still remain unclear. In this work an in vitro test system was adapted, to analyze the molecular effects of genotoxins (ionizing radiation and doxorubicin) on specific cell types of a blood vessel (endothelial cells and smooth muscle cells), as well as on the regenerative potential of progenitor cells. Particular emphasis was placed on the resulting DNA-damage response and the repair capacity of the cells. Therefore initially a protocol that is useful to differentiate mouse embryonic stem cells (mESC) in functionally competent endothelial- and smooth muscle-like cells was established. It was made a crucial point on the phenotypical and functional characterization of the differentiated cells, because the applied methods were also used to analyze the influence of genotxins on the differentiation potential of progenitor cells. The differentiated cells expressed cell type specific marker genes and showed prototypical functions. Comparative gene expression analysis of susceptibility factors, which are involved in DNA-repair, cell cycle regulation and cell death, showed distinct differences in the basal and genotoxin-induced expression, between mESC, endothelial (EC) and smooth muscle cells (SMC). The expression of genes, which are involved in the different DNA-repair mechanisms (HR, NHEJ, BER, MMR and NER) was increased in mESC. SMC showed the lowest basal expression of repair genes, which couldn´t even be induced by the used genotoxins. Furthermore it could be shown, that the expression of genes, which are involved in apoptosis, was increased in mESC und EC compared to SMC. Consistent with these data, analysis of the repair capacity of DNA double-strand breaks showed, that mESC and EC repair these type of DNA damage with a higher efficiency. In addition, the initiation of apoptosis was increased in mESC an EC. The differentiation of mouse embryonic stem cells in vascular cell type was accompanied by distinct alterations in the DNA-damage response capacity. These alterations can not only be ascribed to the differentiation status of a cell, because mESC and EC respond similar to DNA damage. Furthermore the influence of genotoxins on the differentiation potential of progenitor cells in functionally competent EC and SMC was analyzed. The influence of genotoxins seemed to be more agent specific than dose dependent. It could be shown that even high dose of ionizing radiation did not block the differentiation into competent cells, whereas equivalent concentrations of doxorubicin led to a loss of the differentiation potential. The findings highlight the potential of mESC-based in vitro differentiation systems for (1) meaningful toxicological drug assessment and (2) thorough characterization of the impact of DNA repair and DDR mechanisms for angiogenesis and vascular functionality under situation of chronic environmental stress.
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Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Toxikologie
Dokument erstellt am:	27.09.2018
Dateien geändert am:	27.09.2018
Promotionsantrag am:	09.12.2017
Datum der Promotion:	30.08.2018