Dokument: Charakterisierung der Isocitrat-Dehydrogenase 1 im Zusammenhang der Tumorgenese von Gliomen mithilfe der Proteomanalyse
| Titel: | Charakterisierung der Isocitrat-Dehydrogenase 1 im Zusammenhang der Tumorgenese von Gliomen mithilfe der Proteomanalyse | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46892 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20180903-094021-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Overbeck, Nina [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Stühler, Kai [Betreuer/Doktorvater] Jun.-Prof. Dr. Beller, Mathias [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Aufgrund ihres frühen Auftretens in der Tumorgenese sowie der prognostischen Relevanz scheint die Rolle der Mutation der Isocitrat-Dehydrogenase (IDH1) bei Gliomen von großer Bedeutung zu sein. Dennoch sind bisher lediglich Teilaspekte hinsichtlich des entstehenden Onkometaboliten 2-Hydroxyglutarat, welche nicht alle zu beobachtenden Effekte vollumfänglich erklären können, näher untersucht. Funktionelle Aspekte der IDH1 selbst sind allerdings bisher noch weitestgehend unverstanden. Aus diesem Grund war das Ziel dieser Arbeit, ein detaillierteres Bild des funktionellen biologischen Kontexts der wild-typischen und mutierten IDH1 mithilfe der Proteomanalyse zu erstellen.
• Die markierungsfreie differenzielle Analyse der U87MG Zelllinie, welche wild-typische bzw. mutierte IDH1 überexprimiert, ergab eine Quantifizierung von 2.020 Proteinen, von denen 101 Proteine einen signifikanten Abundanzunterschied aufwiesen. Die anschließende Analyse der biologischen Prozesse zeigte keine signifikant angereicherten Prozesse innerhalb dieser Gruppe, so dass davon ausgegangen werden kann, dass die IDH1 Mutation innerhalb des verwendeten Zellmodells keine gravierenden Veränderungen hervorruft. Auch die Proteomanalyse der murinen Stamm- und Vorläuferzellen zeigte keinen starken Einfluss der IDH1 Mutation auf die Proteinabundanzen. • Die Charakterisierung des Phosphoproteoms erlaubte es, nach ihrer erfolgreichen Etablierung, Aussagen über eventuelle Aktivitätsveränderungen und beteiligte Signalwege in neuralen Stamm- und Vorläuferzellen, welche wild-typische bzw. mutierte IDH1 exprimieren, zu treffen. Dies führte zur Identifizierung von 1.887 Proteinen, welche mindestens ein phosphoryliertes Peptid tragen, von denen 540 exklusiv in einer der beiden analysierten Gruppen detektiert wurden. Deren bioinformatorische Analyse zeigte, dass in den IDH1 mutierten Zellen exklusiv identifizierte Phosphoproteine in die Bindung des Tumorsuppressors p53 involviert sind und in dessen negativen Regulierung resultieren könnte. • Eine Analyse der posttranslationalen Modifikationen mithilfe einer Kombination aus Immunpräzipitationen, gegen wild-typische bzw. mutierte HA-gekoppelte IDH1, und massenspektrometrischer Analyse führte zur Identifizierung von vier Phosphorylierungsstellen, welche exklusiv der wild-typischen IDH1 zugeordnet werden konnten. Außerdem konnten für beide Isoformen verschiedene, bisher nicht beschriebene Acetylierungen, Ubiquitinylierungen und Phosphorylierungen identifiziert werden, deren möglicher funktioneller Einfluss auf die Aktivität der IDH1 in weiteren Experimenten geklärt werden müsste. • Eine differenzielle Analyse der Interaktoren zwischen wild-typischer und mutierter IDH1, unter Verwendung der U87MG Zelllinie und einer affinitätsbasierten MS-Methode, ergab keine signifikant veränderten Interaktoren zwischen den IDH1 Isoformen. Eine Untersuchung der generellen Interaktionspartner der IDH1 zeigte, dass die identifizierten Proteine vorrangig an Prozessen beteiligt sind, welche typisch für den Lebenszyklus eines Proteins sind. Dies führt zu dem Schluss, dass IDH1 innerhalb der Zelle keine starken Interaktionen eingeht und nicht in einem funktionellen Komplex organisiert ist. Somit konnten im Rahmen dieser Arbeit mittels proteomanalytischer Methoden die IDH1 und ihre mutierte Isoform, unter Verwendung zweier Zellkulturmodelle, umfassend charakterisiert werden. Hierdurch konnten neue Ausgangspunkte für die Aufklärung ihrer bisher unzureichend erklärten Rolle im Zellmetabolismus sowie für IDH1 vermittelte, 2 Hydroxyglutarat-unabhängige Effekte in der Tumorgenese von Gliomen geschaffen werden.Mutation of isocitrate dehydrogenase 1 (IDH1) plays a significant role in glioma due to the facts that this mutation is an early event in tumorgenesis and has prognostic relevance. A lot is known about the resulting oncometabolite 2-hydroxyglutarate, however the existing results only represent the observed effects to a minor extent. Besides this, the functional aspects of IDH1 are almost undetermined. The goal of this study was to provide a detailed characterization of the functional and biological context of wild-type and mutant IDH1 using proteomic approaches. • Labelfree differential analysis of the U87MG cell line, overexpressing either wild-type or mutant IDH1, yielded quantifications of 2,020 proteins. Within this group 101 proteins displayed a significant change in abundance although subsequent analysis of biological processes revealed no significant enrichment. Therefore, it can be assumed, that IDH1 mutation does not lead to serious alterations in the studied cell model. An additional fact supporting this conclusion is that the proteome analysis of murine neural stem- and progenitor cells revealed no substantial influence of this mutation on protein abundance. • Through successful establishment and implementation of phosphoproteome analysis, conclusions about potential changes in activity and signaling pathways in neural stem- and progenitor cells, expressing wild-type and mutant IDH1, respectively, were drawn. This led to the identification of 1,887 proteins containing at least one phosphorylated peptide, of which 540 were exclusively detected in one of the analyzed groups. The bioinformatic analysis of those 540 proteins revealed, that phosphoproteins only identified in IDH1 mutated cells are involved in binding tumor suppressor p53 and might result in the negative regulation of the tumor suppressor. • Posttranslational modifications were examined with a combination of immunoprecipitation against wild-type or mutant HA-tagged IDH1 and mass spectrometric based analysis. This resulted in identification of four phosphorylation sites unique for wild-type IDH1. Furthermore, it was possible to detect different, not yet described, acetylations, ubiquitinations and phosphorylations for both IDH1 isoforms. A possible functional impact on the activity of IDH1 should be further validated. • The differential analysis of interactors between wild-type and mutant IDH1, using the U87MG cell line and an affinity based MS-method, showed no difference between the IDH1 isoforms. Within the group of general IDH1 interaction partners, the proteins are primarily involved in processes that are substantial for protein lifecycle. This leads to the conclusion that IDH1 has no strong interactions inside the cell and is not organized in a functional complex. This work extensively contributes to the characterization of IDH1 and its mutant isoform by using proteome analysis and two different cell culture models. It provides new aspects to elucidate the not yet fully understood role of IDH1 in cell metabolism, as well as IDH1-mediated, 2 hydroxyglutarate independent effects in tumorgenesis of glioma. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 03.09.2018 | |||||||
| Dateien geändert am: | 03.09.2018 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 13.06.2018 | |||||||
| Datum der Promotion: | 29.08.2018 |
