Dokument: Die Rolle von RIP2 bei der Aktivierung von NF-ĸB und der Regulation der Metastasierung durch XIAP

Titel:	Die Rolle von RIP2 bei der Aktivierung von NF-ĸB und der Regulation der Metastasierung durch XIAP
Weiterer Titel:	The role of RIP2 in the activation of NF-ĸB and the regulation of metastasis by XIAP
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46793
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180817-091952-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Mersch, Sabrina [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 12,01 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.08.2018 / geändert 16.08.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Krieg, Andreas [Gutachter] Prof. Dr. Heise, Henrike [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das kolorektale Karzinom ist eine der häufigsten Krebserkrankungen in Deutschland. Obwohl bereits viele Therapieansätze zur Verfügung stehen, ist die Patientensterblichkeit weiterhin hoch. Dabei geht die Hauptsterblichkeit nicht vom Primärtumor, sondern von auftretenden Metastasen und Rezidiven aus. Jedoch sind die molekularen Mechanismen dieser Metastasierung bisher nicht vollständig verstanden. Ein besonderes Augenmerk liegt hierbei auf chronischen Entzündungsreaktionen, da deutlich wurde, dass inflammatorische Prozesse an der Progression des Kolonkarzinoms beteiligt sind. Dabei lag der Fokus der Wissenschaft innerhalb der letzten Jahre vermehrt auf den sogenannten „Toll-like Rezeptoren (TLR)“. Diese sind für die Homöostase des Darms und die Initiation einer ersten Immunantwort auf eindringende, pathogene Keime verantwortlich, weisen aber auch onkogene Effekte im Kolonkarzinom auf. Durch diese Rezeptoren wird der Transkriptionsfaktor NF-ĸB aktiviert, wodurch es schließlich zur Ausschüttung verschiedener pro-inflammatorisch wirkender Zytokine und Chemokine kommt. Eine konstitutive Aktivierung von NF-ĸB führt hingegen zu einer verstärkten angiogenetischen Aktivität im betroffenen Gewebe, sowie zu vermehrtem migratorischem und invasivem Verhalten der Zellen. Eine mit den TLR verwandte Familie sind die sogenannten „NOD-Rezeptoren“. Diese liegen zytoplasmatisch vor, erkennen gleichermaßen pathogene Strukturen und aktivieren über ihren entsprechenden Signalweg ebenfalls NF-ĸB. Innerhalb dieses Signalwegs traten verschiedene Mitglieder der Inhibitor of Apoptosis Proteinfamilie (IAP) zunehmend in den Vordergrund. So konnte gezeigt werden, dass XIAP eine wichtige Funktion bei der Signaltransduktion und der Aktivierung von NF-ĸB einnimmt, indem es als E3-Ubiquitin-Ligase die Serin-ThreoninTyrosin-Kinase RIP2 ubiquitiniert und es somit zu einer Aktivierung von NF-ĸB kommt. Da XIAP sowohl als Tumorpromoter als auch als prognostischer Faktor im Kolonkarzinom gilt, soll in dieser Arbeit seine Rolle durch die Interaktion mit den Proteinen RIP2 und TAB1 bei der Aktivierung von NF-ĸB innerhalb des NOD-Signalwegs untersucht werden. Da die genauen Mechanismen der Interaktion und eine mögliche onkogene Bedeutung der NOD-Signalkaskade noch nicht vollständig untersucht sind, wurde in der hier vorliegenden Arbeit die Interaktion der drei genannten Proteine innerhalb des NOD-Signalwegs in der Kolonkarzinom-Zelllinie HCT116 untersucht. Zunächst wurden TMA-Proben von 273 Kolonkarzinom-Patienten hinsichtlich der Proteinexpression der im NOD-Signalweg beteiligten Proteine NOD1, NOD2, XIAP, RIP2 und TAB1 immunhistochemisch ausgewertet. Hierbei zeigte sich ein signifikanter Einfluss der XIAP-Expression auf das Gesamtüberleben der Patienten mit Kolonkarzinomen in der uni- und multivariaten Analyse. Auch für RIP2 konnte ein signifikanter Einfluss auf das Überleben der Patienten nachgewiesen werden. Unter Zuhilfenahme des Zinkfingernuklease-Systems konnten anschließend verschiedene genetische Knock Out Klone für die Gene RIP2 und TAB1 in der Zelllinie HCT116 generiert werden. Mit Hilfe eines RNA-Microarrays wurde parallel ein Zielgenpanel etabliert, dessen Expression durch die XIAP-abhängige NF-ĸB-Aktivierung innerhalb des NOD-Signalwegs kontrolliert wird. Dieses diente in den folgenden Versuchen als ein „Read-Out-System“. Die erhaltenen Ergebnisse auf molekularer und funktioneller Ebene weisen darauf hin, dass TAB1 eine additive Rolle bei der Signaltransduktion spielt. In den durchgeführten Stimulationsversuchen sowie in funktionellen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass die Signalweiterleitung auch während eines TAB1 Knock Outs weiterhin, wenn auch in verminderter Intensität, gegeben war. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die NF-ĸB Aktivität sowie die Expression der entsprechenden Zielgene nach einem RIP2 Knock Out auch nach Stimulation der NOD-Signalkaskade mit spezifischen Liganden nicht mehr gegeben war. Weiterhin wiesen diese Zellen eine verminderte Invasionsfähigkeit auf, die auch durch eine stabile XIAP-Überexpression nicht verstärkt werden konnte. In Rekonstitutionsversuchen wurde deutlich, dass die Interaktion von RIP2 mit XIAP für die NF-ĸB Aktivierung von essentieller Bedeutung ist. In der hier vorliegenden Arbeit konnte somit gezeigt werden, dass RIP2 ein essentieller Faktor der XIAP-abhängigen Signalweiterleitung im NOD-Signalweg ist, die Invasivität von Tumorzellen in vitro reguliert und mit dem Gesamtüberleben von Patienten mit Kolonkarzinom assoziiert ist. Daher sollte es als potentielle therapeutische Zielstruktur verstärkt betrachtet und untersucht werden. Colorectal cancer is one of the top three cancerous diseases in Germany. Although many therapies are available for these patients, the mortality rate remains high. This is mainly due to metastasis and recurrence of the disease, while the primary tumors have less effect on survival rates. Even now, molecular mechanisms of metastasis are not completely understood. Special attention needs to be drawn to chronic inflammation, which is one of the main aspects of tumorigenesis of gastro-intestinal carcinomas. Within the last years, research was focused on so-called “Toll-like receptors (TLR)”, which are responsible for homeostasis of the gut, for initiation of the innate immune response in regard of cell-invading pathogenic microbes, as well as for oncogenic effects in colon carcinomas. Through activation of these receptors, NF-ĸB is released from its inhibitors and migrates into the nucleus of the cell, where it activates target genes, leading to secretion of several inflammatory cytokines and chemokines. In contrast, a constitutive activation of NF-ĸB leads to enhanced angiogenic activity in the affected tissue, as well as to migratory and invasive behavior of the cells. The NOD-receptor family is related to TLRs. While TLR-receptors are membrane-bound, NOD-receptors are found in the cytoplasm of cells. They also recognize pathogenic structures of microbes and viruses, and activate NF-ĸB via their special signaling pathway. Within this pathway, several members of the “inhibitor of apoptosis protein” (IAP) family, which participate in signal transduction, have come to the fore. It was shown that XIAP holds an important function in signal transduction and in activation of NF-ĸB, by using its E3-ubiquitin-ligase-activity to ubiquitinize and therefore activate serine-threonine-tyrosine kinase RIP2. Since XIAP is known to be a tumor promoting protein and furthermore serves as a prognostic factor in colorectal carcinomas, it is of great interest to investigate its role in NOD signal transduction and to elucidate its need to interact with RIP2 and TAB1. Because the detailed mechanisms of this interaction and the potential oncogenic impact of the NOD-signaling pathway have not yet been investigated in detail, this doctoral thesis focuses on the analysis of the protein interactions between XIAP and RIP2, as well as between XIAP and TAB1, an adapter protein of the TAB/TAK-complex in the colon carcinoma cell line HCT116. Initially, TMA-samples of 273 colon carcinoma patients were immunohistochemically evaluated regarding the expression of proteins involved in NOD-signaling pathways such as NOD1, NOD2, XIAP, RIP2 and TAB1. Here, a significant impact of XIAP expression on overall patient survival was found in uni- and multivariate analysis. Additionally, RIP2 displayed a significant impact on the overall survival of patients. By using a zinkfinger-nuclease system, several genetic HCT116 knock out clones for the genes of RIP2 and TAB1 could be established. In parallel, through the use of RNA-microarray, XIAP-dependent NF-ĸB target genes were detected, then taken as “read-out system” for further experiments. Through these results obtained on molecular and functional basis it could be concluded that TAB1 only has an additive role in signal transduction of the NOD-signaling cascade. In stimulation studies, as well as in functional tests, signal transduction was shown to be still present in HCT116 TAB1-/- clones, though in a reduced capacity. Furthermore, the results of this thesis show that NF-ĸB expression, as well as the expression of the target gene panel, was inactivated after the knock out of RIP2 in the HCT116 cell line and also couldn’t be reactivated by ligand specific stimulation of the NOD-receptors. Also, RIP2-/- cells displayed reduced invasiveness. Moreover, invasiveness could not be enhanced by XIAP overexpression in RIP2 knock out cells. In reconstitution trials it became clear that interaction between RIP2 and XIAP is of essential relevance for NF-ĸB activation. In this work, it was demonstrated that RIP2 is an essential factor of XIAP-dependent signal transduction in the NOD-signaling pathway. It regulates tumor invasion in vitro, and is correlated with overall survival in patients with colon cancer. Hence, RIP2 would be an interesting target of cancer therapy and is worth further investigation.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	17.08.2018
Dateien geändert am:	17.08.2018
Promotionsantrag am:	09.10.2017
Datum der Promotion:	16.01.2018