Dokument: High-resolution structure of the SAM domain homodimer of the murine adapter protein SLY1

Titel:	High-resolution structure of the SAM domain homodimer of the murine adapter protein SLY1
Weiterer Titel:	Hoch aufgelöste Struktur des Homodimers der SAM-Domäne des murinen Adapterproteins SLY1
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46763
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180816-130611-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kukuk, Laura [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 10,23 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 14.08.2018 / geändert 14.08.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] PD. Dr. König, Bernd [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Protein SH3 domain containing protein expressed in lymphocytes-1 (SLY1) ist ein 380 Aminosäure großes Adapterprotein, das bevorzugt in Lymphozyten produziert wird. SLY1 spielt eine Rolle in der adaptiven Immunantwort des Körpers und ist von Bedeutung für die Reifung und die korrekte Funktion von B- und T-Lymphozyten und NK-Zellen. Es enthält ein N-terminales zweigeteiltes Kernlokalisierungssignal (nuclear localisation signal; NLS), eine Src homology 3- (SH3) und eine sterile alpha motif- Domäne (SAM). SH3- und SAM-Domänen sind Interaktionsdomänen, die die Komplexbildung mit anderen Biomakromolekülen ermöglichen. Experimentelle Daten weisen darauf hin, dass SLY1 mit Proteinen der 14-3-3-Familie und verschiedenen ribosomalen Proteinen interagiert. Allerdings sind die Rollen und die biologischen Zielbereiche der SH3- und SAM-Domänen noch ungeklärt. SAM-Domänen sind bekanntermaßen in der Lage, Proteine, Nucleinsäuren und Lipide zu binden. Außerdem haben viele SAM-Domänen die Eigenschaft mit sich selbst oder weiteren SAM-Domänen Homo- und Hetero-Oligomere zu bilden. Aufgrund dieser Besonderheiten von SAM-Domänen ist es schwierig, die Rolle, die eine SAM-Domäne im Kontext eines spezifischen Proteins spielt, ohne Kenntnis der Struktur und des Oligomerisationszustands der SAM Domäne zu beurteilen. In dieser Arbeit wurde die dreidimensionale Struktur und der Oligomerisationszustand der SAM-Domäne von SLY1 mit biophysikalischen Methoden unter Verwendung eines SLY1-Konstruktes (P254–E321) bestimmt, welches die gesamte gefaltete SAM-Domäne (P254–Y316) enthielt. Mit Hilfe von Kernmagnetresonanz-Spektroskopie (nuclear magnetic resonance; NMR) und analytischen Ultrazentrifugations-Experimenten konnte gezeigt werden, dass SLY1 SAM sich in einem Monomer-Dimer-Gleichgewicht befindet, welches durch eine Gleichgewichts-Dissoziationskonstante im niedrigen mikromolaren Bereich charakterisiert ist. Die Verlängerung des N-terminus des SLY1-Konstruktes um eine Region positiv geladener Aminosäuren der flankierenden SLY1-Sequenz resultiert in einer Erhöhung der Bindungsaffinität der Dimerisierung um das Sechs- bis Achtfache. Damit ist das SLY1 SAM-Homodimer um eine Größenordnung stabiler als alle anderen bisher beschrieben SAM-Homodimere. Chemischer Austausch auf Grund des Monomer-Dimer-Gleichgewichtes führte zu starken Linienverbreiterungen der Signale in den anfänglichen NMR-Spektren. Daher konnte zunächst keine Strukturaufklärung des SAM-Dimers mittels NMR-Spektroskopie erfolgen. Der Austausch von S320 am flexiblen C-terminus des Konstrukts gegen ein Cystein ermöglichte es, die beiden SAM-Untereinheiten des Dimers zu verbrücken. Die Struktur des verbrückten SLY1 SAM-Dimers wurde mittels multidimensionaler, heteronuklearer NMR-Spektroskopie bestimmt. Die Lösungsstruktur des SAM-Monomers von SLY1 weist die für SAM-Domänen charakteristische Fünf-Helix-Faltung (α1–α5) auf. Interessanterweise bildet die SAM-Domäne von SLY1 ein Homodimer unter Verwendung einer für SAM-Domänen bisher noch nicht beschriebenen Interaktionsfläche. Diese Grenzfläche wird hauptsächlich durch die beiden langen C-terminalen Helices α5 und α5‘ der Domänen gebildet, welche gegeneinander gepackt sind. Zusätzliche wird das Dimer durch intermolekulare Kontakte zwischen Aminosäureresten in Helices α5 und α1‘ und der α1‘/α2‘-Schleife sowie zwischen Aminosäureresten der beiden C-Termini stabilisiert. Die Lösungsstruktur des SLY1 SAM-Homodimers wird durch die Röntgenkristallstruktur der unverbrückten Wildtyp SLY1 SAM-Domäne bekräftigt, welche mit einer maximalen Auflösung von 2,05 Å bestimmt wurde. Der Vergleich der beiden Dimer-Strukturen mittels Superpositionierung ergab eine mittlere quadratische Abweichung der Cα-Positionen von 1,13 Å, was auf eine sehr hohe Ähnlichkeit der globalen Faltung beider SAM-Dimere hinweist. In der hier bestimmten Struktur des SLY1 SAM-Dimers präsentieren beide SAM-Untereinheiten ein für SAM-Domänen typisches Interaktionsmotiv auf der zugänglichen Oberfläche. Das SAM-Dimer könnte mit Hilfe dieser Interaktionsmotive ein Gerüst für SLY1 vermittelte Proteinwechselwirkungen mit anderen SAM-Domänen-enthaltenden Proteinen bilden. The murine adapter protein SLY1 (SH3 domain containing protein expressed in lymphocytes-1) is 380 amino acids in length and preferentially expressed in lymphocytes. SLY1 plays a role in the adaptive immune system and is required for the maturation and correct function of T-lymphocytes, B-lymphocytes and NK cells. The domain architecture of SLY1 comprises an N-terminal bipartite nuclear localisation signal (NLS), a Src homology 3 (SH3) domain and a sterile alpha motif (SAM) domain. Both, the SH3 and SAM domains, are interaction motifs that function by facilitating complex formation with biological macromolecules. Although data indicate that SLY1 interacts with 14-3-3 proteins and multiple ribosomal proteins, the function of, and biological targets that interact with the SH3 and SAM domains remain unresolved. SAM domains have been shown to bind proteins, nucleic acids and lipids. A prominent feature of SAM domains is their ability to self-associate in a variety of homo- and heterotypic interactions. These features make the assessment of SAM domain function in the context of a SAM domain containing protein challenging without detailed knowledge of the SAM domain structure and oligomerisation state. In this study, the three-dimensional structure and oligomeric state of a SLY1 SAM construct that comprised the folded core of the SLY1 SAM domain (P254– Y316) was determined by biophysical methods. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and analytical ultracentrifugation studies of SLY1 SAM revealed that the domain exists in a monomer-dimer equilibrium with an equilibrium dissociation constant in the lower micromolar range. Moreover, extension of the N-terminus to include a positively charged region of SLY1 increased the affinity 6–8-fold, making the SLY1 SAM dimer one order of magnitude more stable than previously studied SAM domain homodimers. Initial NMR analysis of the SLY1 SAM domain revealed severe line-broadening of signals because of chemical exchange due to the monomer-dimer equilibrium, which prohibited structure determination. To eliminate this chemical exchange process, S320 at the flexible C-terminal end of the SAM construct was exchanged for a cysteine residue to enable cross-linking of the two SAM monomers. The structure of the cross-linked SLY1 SAM dimer was solved by multidimensional heteronuclear NMR spectroscopy. The solution structure of the SLY1 SAM domain adopts the canonical five-helix fold observed for other SAM domains. Interestingly, the SLY1 SAM domain forms a symmetric homodimer through a novel dimer interface. This interface is formed primarily between the two long C-terminal helices α5 and α5' of the domains packing against each other. Additional intermolecular contacts between amino acids in helices α5 and α1' as well as loop α1’/α2’, and also between residues in the two C-termini further stabilise the dimer. The solution structure of the SLY1 SAM homodimer was corroborated by the structure of the wild-type SLY1 SAM determined by X-ray crystallography. The structure was solved to a resolution of 2.05 Å. Comparison of the solution and crystal structures yielded a Cα root-mean-square-deviation of 1.13 Å, indicating a high global fold similarity of the SAM dimer. The structure of the SLY1 SAM dimer presents a typical SAM domain interaction motif on each monomer that may provide a scaffold for SLY1 mediated protein interactions with other SAM domain containing proteins.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	16.08.2018
Dateien geändert am:	16.08.2018
Promotionsantrag am:	28.05.2018
Datum der Promotion:	26.06.2018