Dokument: Structure-function studies on the stereochemical promiscuity of ThDP-dependent enzymes
| Titel: | Structure-function studies on the stereochemical promiscuity of ThDP-dependent enzymes | |||||||
| Weiterer Titel: | Struktur-Funktionsstudien zur stereochemischen Promiskuität von ThDP-abhängigen Enzymen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46742 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20180813-110900-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Baierl, Anna [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Martina Pohl [Gutachter] Prof. Urlacher, Vlada [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | thiamine diphosphate, decarboxylase, transketolase, carboligation, stereoselectivity, biocatalysis | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Thiamine diphosphate (ThDP)-dependent enzymes are versatile tools catalysing the stereoselective formation of chiral building blocks such as α-hydroxy ketones. They can be categorised in nine structural superfamilies, which all share two conserved domains that form the active site with ThDP bound at the domain interface. Of these, the family of ThDP-dependent decarboxylases (DCs) has been studied most extensively. In previous studies, a highly predictive two-state model has been developed that explains the stereoselectivity of DCs for the 1,2-additions of (decarboxylated) α-ketoacids (donor substrate) and aldehydes (acceptor substrate) by the relative orientation of the substrate side chains prior to C-C-bond formation. This model enables the stereoinversion of the predominantly R-selective DCs with few amino acid substitutions that open a pocket as an alternative binding site of the acceptor side chain (antiparallel to the donor side chain), which is a prerequisite for S-selectivity. The aim of this thesis was to evaluate the model for further ThDP-dependent DCs (1) and to transfer the model on another structural family of ThDP-dependent enzymes, the transketolases (TKs) (2).
(1) Evaluation of the stereoselectivity model for YerE from Pseudomonas protegens (PpYerE): PpYerE catalyses the R-selective carboligation of (decarboxylated) pyruvate with non-activated ketones besides aldehydes as acceptor substrates, which increases the product platform that is accessible with ThDP-dependent DCs. An antiparallel acceptor binding pocket could be opened by a single amino acid substitution (V479A), but the size of this pocket was restricted by the backbone of an α-helix. Several attempts to enlarge the pocket to host a phenylring did not succeed in creating S selective variants for the formation of phenylacetlycarbinol (PAC) from pyruvate (donor) and benzaldehyde (acceptor). However, for the smaller acceptor substrates n-pentanal and propanal the stereoselectivity could be shifted towards the S-product, even though no high enantiomeric excess was achieved. The stereoselectivity with hexan-3,4-dion as acceptor was as well influenced. This shows that the stereoselectivity model is also valid for PpYerE, but not generally applicable for stereoinversion with large acceptor substrates. (2) Transfer of the stereoselectivity model on transketolases (TKs): Transketolases are S-selective even though no antiparallel acceptor binding pocket could be found within the active site. To explain this natural S-selectivity, the existing stereoselectivity model was extended based on literature data, yielding a four-state model that includes the relative orientation of the substrate functional groups. As a consequence, two strategies may be followed to create TK variants with inverted stereoselectivity: i. opening of an antiparallel acceptor binding pocket as described for DCs and ii. changing the orientation of the acceptor carbonyl group relative to the donor hydroxy group. Both strategies were investigated by site-directed mutagenesis studies with Escherichia coli TK (EcTK). Overall, the four-state model proved to be far more complex and less predictive than the two-state model. Nevertheless, it provides a first framework to understand the mechanism steering the stereoselectivity of TKs. Thereby, H26, H261 and F434 were identified as key-residues to influence the stereoselectivity.Thiamindiphosphat (ThDP)-abhängige Enzyme sind vielseitige Werkzeuge, welche die stereoselektive Bildung chiraler Bausteine, wie z.B. α Hydroxyketone, katalysieren. Sie lassen sich in neun strukturelle Familien einteilen. Diese haben zwei konservierte Domänen gemeinsam, welche das aktive Zentrum bilden in dem ThDP an der Grenzfläche der Domänen gebunden ist. Von diesen wurde die Familie der ThDP-abhängigen Decarboxy¬lasen (DCs) am intensivsten untersucht. In früheren Studien wurde ein sehr vorhersagekräftiges 2-Zustands-Modell entwickelt, das die Stereoselektivität von DCs für 1,2-Additionen von (decarboxylierten) α-Ketosäuren (Donorsubstrat) und Aldehyden (Akzeptorsubstrat) durch die relative Orientierung der Substratseitenketten vor der C-C-Bindungsknüpfung erklärt. Dieses Modell ermöglicht die Stereoinversion der vorwiegend R-selektiven DCs durch Substitution weniger Aminosäuren, wodurch eine Tasche als alternative Bindestelle für die Akzeptorseitenkette geöffnet wird (antiparallel zur Donorseitenkette), was eine Voraussetzung für S-Selektivität ist. Das Ziel dieser Arbeit war es, das Modell für weitere ThDP-abhängige DCs zu evaluieren (1) und auf eine andere strukturelle Familie von ThDP-abhängigen Enzymen, die Transketolasen, zu übertragen (2). (1) Evaluierung des Stereoselektivitätsmodells für YerE aus Pseudomonas protegens (PpYerE): PpYerE katalysiert die R-selektive Carboligation von Pyruvat und nicht aktivierten Ketonen, zusätzlich zu Aldehyden, als Akzeptorsubstrate, wodurch die Produktplattform von ThDP-abhängigen DCs vergrößert wird. Eine antiparallele Akzeptor-Bindetasche konnte durch Substitution einer einzelnen Aminosäure (V479A) geöffnet werden, aber die Größe dieser Tasche wurde durch das Rückgrat einer α-Helix begrenzt. In verschiedenen Ansätzen zur Vergrößerung der Tasche für die Aufnahme eines Phenylrings gelang es nicht, S-selektive Varianten für die Bildung von Phenylacetlycarbinol aus Pyruvat (Donor) und Benzaldehyd (Akzeptor) zu erzeugen. Für die kleineren Akzeptorsubstrate n-Pentanal und Propanal konnte die Stereoselektivität jedoch in Richtung des S-Produkts verschoben werden, obwohl kein hoher Enantiomerenüberschuss erzielt wurde. Die Stereoselektivität mit Hexan-3,4-dion wurde ebenfalls beeinflusst. Dies zeigt, dass das Stereoselektivitätsmodell zwar auch für PpYerE gültig ist, aber nicht generell für die Stereoinversion mit großen Akzeptorsubstraten anwendbar ist. (2) Übertragung des Stereoselektivitätsmodells auf Transketolasen (TKs): Transketolasen sind S-selektiv, obwohl keine antiparallele Akzeptor-Bindetasche im aktiven Zentrum gefunden werden konnte. Um diese natürliche S-Selektivität zu erklären, wurde das bestehende Stereoselektivitätsmodell basierend auf Literaturdaten zu einem 4-Zustands-Model zu erweitert, das zusätzlich die relative Orientierung der funktionellen Gruppen der Substrate beinhaltet. Demnach können zwei Strategien verfolgt werden, um TK-Varianten mit umgekehrter Stereoselektivität zu erzeugen: i. die Öffnung einer antiparallelen Akzeptor-Bindetasche, wie es für DCs beschrieben ist, und ii. die Änderung der Orientierung der Akzeptor-Carbonylgruppe relativ zur Donor-Hydroxy¬gruppe. Beide Strategien wurden durch ortsspezifische Mutagenesestudien mit Escherichia coli TK (EcTK) untersucht. Insgesamt erwies sich das 4-Zustands-Modell als weitaus komplexer und weniger vorhersagekräftig als das 2-Zustands-Modell. Dennoch bietet es einen ersten Rahmen, um den Mechanismus, der die Stereoselektivität von TKs steuert, zu erklären. Dabei wurden H26, H261 und F434 als Schlüsselstellen identifiziert, um die Stereoselektivität zu beeinflussen. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Sonstige Einrichtungen/Externe » Institute in Zusammenarbeit mit der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf » Institut für Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich GmbH | |||||||
| Dokument erstellt am: | 13.08.2018 | |||||||
| Dateien geändert am: | 13.08.2018 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 14.05.2018 | |||||||
| Datum der Promotion: | 04.06.2018 |
