Dokument: Quantifizierung von Interleukin-6/löslichen Interleukin-6 Rezeptorkomplexen und Etablierung eines Nanopartikel-Zelltracking Systems über synthetische Cargo-Internalisierungsrezeptoren

Titel:	Quantifizierung von Interleukin-6/löslichen Interleukin-6 Rezeptorkomplexen und Etablierung eines Nanopartikel-Zelltracking Systems über synthetische Cargo-Internalisierungsrezeptoren
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46547
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180720-085439-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Baran, Paul [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,50 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.07.2018 / geändert 18.07.2018
Beitragende:	Prof. Dr. rer. nat. Scheller, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. Flögel, Ulrich [Gutachter]
Stichwörter:	Interleukin-6, Trans-Signalweg, Interleukin-6/löslicher Interleukin-6 Rezeptorkomplex, Synthetische Cargo-Internalisierungsrezeptoren
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das pleiotrope Zytokin IL-6 ist ein wichtiger Mediator der Immunantwort und hat wichtige Funktionen in vielen physiologischen und pathophysiologischen Prozessen. Der klassische Signalweg wird von IL 6 über den membranständigen IL-6R und gp130 aktiviert und steht im Zusammenhang mit regenerativen und anti-inflammatorischen Prozessen. Der IL-6 Trans-Signalweg erfolgt über den löslichen IL-6R, sowie gp130, und reguliert pro-inflammatorische Prozesse in chronisch-entzündlichen und Autoimmunerkrankungen. Im Serum von gesunden Menschen sind kaum detektierbare Mengen an IL-6 vorhanden (1-10 pg/ml), sowie mittlere bis hohe ng/ml Mengen an sIL-6R und sgp130. Bei Entzündungen kann sich die Menge an IL-6 im Serum allerdings drastisch erhöhen, bis in den hohen ng/ml Bereich, und die Menge an sIL 6R kann um den Faktor 2-3 ansteigen. Entzündungs-bedingte Mengen von IL-6 führen zur Bildung von IL-6/sIL-6R Komplexen, einhergehend mit einer verstärkten Aktivierung des Trans-Signalweges. Bis zum heutigen Zeitpunkt war es allerdings nicht möglich, die Menge an IL 6/sIL-6R Komplexen experimentell zu bestimmen und Schätzungen darüber beruhten bisher auf Affinitäts-basierten Berechnungen. In ersten Teil dieser Arbeit wurde ein neuer ELISA verwendet, der spezifisch den IL-6/sIL-6R Komplex detektiert. Als erstes zeigt die ELISA-gestützte Quantifizierung, dass die Menge an IL-6/sIL-6R Komplexen direkt abhängig zu der vorhandenen Konzentration an IL-6 und sIL-6R ist. Zudem sind die ELISA-ermittelten Mengen von IL-6/sIL-6R Komplexen mit rekombinanten IL-6 und sIL-6R, oder endogenem sIL-6R in humanem Serum, deutlicher geringer, als die Mengen der Affinitäts-basierten Berechnungen. Diese Daten zeigen, dass deutlich mehr freies IL-6 vorhanden ist, um den klassischen Signalweg zu induzieren, als bisher erwartet. Zusätzlich konnte gezeigt werden, dass alle IL-6 und in humanem Serum nahezu alle sIL-6R Moleküle im Komplex vorliegen können, über die Stabilisierung mit dem Nanobody VHH6. VHH6 bindet spezifisch an den IL-6/sIL-6R Komplex und nicht an IL-6 oder sIL-6R alleine. Des Weiteren wurde bisher vermutet, dass endogenes sgp130 zusammen mit sIL-6R ein Puffersystem bildet, um eine erhöhte systemische IL-6-induzierte Signalweiterleitung während Entzündungen zu begrenzen. In dieser Arbeit wurde zudem gezeigt, dass endogenes sgp130 auch nur zu einem geringeren Anteil an IL-6/sIL-6R Komplexe bindet, als bisher vermutet. Es kann daher angenommen werden, dass sgp130 nicht dazu in der Lage ist, eine erhöhte systemische IL-6-induzierte Signalweiterleitung während Entzündungen zu inhibieren. Sgp130 bildet daher offenbar nur transiente IL-6/sIL-6R/sgp130 Komplexe, um so die Serumhalbwertszeit von IL-6 zu erhöhen. Bildgebende Verfahren sind ein wichtiges Hilfsmittel, um die Mechanismen von Entzündungen zu erforschen und die zeitlichen Abläufe von Immunzellinfiltrationen zu untersuchen. Magnetresonanztomographie (MRT) ist eine geeignete Methode um Entzündungsvorgänge zu analysieren, da es in tiefliegenden Gewebeschichten präzise anatomische Bilder erzeugen kann. Um spezifische Gewebebereiche oder Zellen zu detektieren, sind Kontrastmittel von großer Wichtigkeit. Um präzise Bilder von Zielstrukturen zu erzeugen, werden unter anderem Perfluorkarbon-Nanoemulsionspartikel (PFC-NEs) verwendet. In präklinischen murinen Krankheitsmodellen konnte hiermit die zeitliche Migration von phagozytierenden Immunzellen, wie Monozyten und Makrophagen, sehr detailliert untersucht werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein synthetisches Cargo-Internalisierungsrezeptor (CIR)-System generiert, um auch nicht-phagozytierende Immunzellen, wie T-Zellen oder andere Immunzelltypen, spezifisch mittels PFC-NEs zu detektieren. Für diesen Zweck beinhalten alle drei CIRs einen extrazellulär vorhandenen GFP-Nanobody, welcher spezifisch GFP bindet. Des Weiteren besitzen die CIRs verschiedene intrazelluläre Domänen, welche die Internalisierungsrate von GFP bzw. GFP-gekoppelten Nanopartikeln steuern. Eine effiziente Internalisierung von kleineren Nanopartikeln (< 0,5 µM) erfolgt über Endozytose (CIR1 und CIR2) und von größeren Nanopartikeln (> 0,5 µM) über Phagozytose (CIR3). CIR-exprimierende Zellen können auch mit GFP-PFCs spezifisch mittels MRT detektiert werden. Die Detektion dieser Zellen war über das 19F-Signal sogar deutlich höher, als die Detektion von isolierten murinen phagozytierenden Immunzellen aus dem Blut. Ein weiterer wichtiger Aspekt des GFP/CIR-Systems ist, dass die Bindung von GFP-PFCs zu keiner Aktivierung von intrazellulären Signalwegen führt, wodurch sonst Zelleigenschaften beeinflusst werden könnten. Abschließend wurde untersucht, ob dieses System in vivo in transgenen Mäusen funktioniert. Für diesen Zweck sollte CIR2 in transgenen Mäusen exprimiert werden. Allerdings lag keine Expression des CIR2-Proteins in dieser Mauslinie vor. Für weitere Untersuchung dieses Systems in vivo wird daher eine weitere transgene Mauslinie erstellt, bei dem die Expression von CIR2 unter Kontrolle des CD4-Promotors steht. Dies soll Untersuchungen zur Verteilung von T-Zellen in Mäusen in entzündlichen Krankheitsmodellen mittels MRT ermöglichen. The pleiotropic cytokine IL-6 is an important mediator of the immune response and plays a critical role in many physiological and pathophysiological processes. Classic signaling mediated by IL-6 via the membrane-bound IL-6R and gp130 is associated with regenerative and anti-inflammatory processes. IL-6 trans-signaling mediated by IL-6 via the soluble IL-6R and gp130 regulates pro-inflammatory processes in chronic inflammatory and autoimmune diseases. In healthy individuals serum levels of IL-6 are hardly detectable (1-10 ng/ml), sIL-6R and sgp130 are present in the medium to upper ng/ml range, respectively. During inflammation, the serum level of IL-6 can rise dramatically (up to higher ng/ml) and serum levels of sIL-6R can increase 2-3 fold. Inflammatory IL-6 levels result also in the formation of IL-6/sIL-6R complexes, accompanied by an increased activation of the trans-signaling pathway. Until now, it was not possible to experimentally quantify IL-6/sIL-6R complexes, thereby estimations were based on affinity-based calculations. In the first part of this work, a novel ELISA was used which specifically detect IL-6/sIL-6R complexes. First of all, ELISA-based quantification demonstrates that the amounts of IL-6/sIL-6R complexes are directly dependent on the concentrations of IL-6 and sIL-6R. Importantly, the amounts of IL-6/sIL-6R complexes determined by ELISA with recombinant IL-6 and sIL-6R or endogenous sIL-6R from human serum were much lower as those calculated by affinity-based calculations. These data show that considerably more IL-6 is available to induce classic signaling than expected. Additionally it could be shown that all IL-6 and almost all sIL-6R molecules can be forced into IL-6/sIL-6R-complexes, by stabilization with the nanobody VHH6. VHH6 specifically binds to IL-6/sIL-6R complexes but not to IL-6 or sIL-6R alone. Moreover, it has been suggested that endogenous sgp130 together with sIL-6R forms a buffer system to restrict overshooting systemic IL-6 induced-signaling during inflammation. In this work it is shown that the ability of endogenous sgp130 to bind to IL-6/sIL-6R complexes is also much lower as predicted. This strongly suggests that sgp130 is not able to inhibit overshooting systemic IL-6 signaling during inflammation because it only forms transient IL-6/sIL-6R/sgp130 complexes which might function to prolong the serum half-life of IL-6. Imaging techniques are important tools to study the mechanisms of inflammation and to investigate the timing of immune cell infiltration. Magnetic resonance imaging (MRI) is a suitable method for analyzing inflammatory processes because it can produce precise anatomical images in deep tissue layers. For this reason, contrast agents are of great importance for the detection of specific tissues or cells. To produce precise images of target structures, perfluorocarbon-nanoemulsions (PFC-NEs) are used. In preclinical murine inflammatory disease models the timing of phagocytic immune cell migration, like monocytes and macrophages, has been investigated in great detail by this method. In the second part of this work, a synthetic Cargo-Internalization-Receptor (CIR)-system was generated in order to detect non-phagocytic immune cells, like T-cells and other types of immune cells, by PFC-NEs. For this purpose three synthetic CIRs contain an extracellular GFP-nanobody that specifically binds to GFP. Furthermore the CIRs have different intracellular domains which regulate the rates of internalization of GFP or GFP-coupled nanoparticles. An efficient internalization of smaller nanoparticles (< 0.5 µM) is carried out by endocytosis (CIR1 and CIR2) and of larger nanoparticles (> 0.5 µM) by phagocytosis (CIR3). CIR-expressing cells could also be detected specifically with GFP-PFCs by MRI. The detection of these cells by 19F signal was actually significantly higher than the detection of murine phagocytic cells isolated from blood. Another important aspect of the GFP/CIR-system is that the binding of GFP-PFCs did not lead to an activation of intracellular signaling pathways, which could otherwise affect cell properties. Finally it was investigated whether this systems functions in vivo in transgenic mice. For this purpose CIR2 should be expressed in transgenic mice. However there was no expression of the CIR2-protein in this mouse line. For further investigations of this system in vivo another transgenic mouse line will be generated, in which the expression of the CIR2 is under the control of the CD4-promotor. This will allow the investigation of T-cell distribution in mice in inflammatory disease models through MRI.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	20.07.2018
Dateien geändert am:	20.07.2018
Promotionsantrag am:	28.05.2018
Datum der Promotion:	11.07.2018