Dokument: Fusion tag-based immobilization methods for the one-step purification and immobilization of enzymes

Titel:	Fusion tag-based immobilization methods for the one-step purification and immobilization of enzymes
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46512
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180720-083649-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Döbber, Johannes [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 24,31 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 16.07.2018 / geändert 16.07.2018
Beitragende:	PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter] Prof. Dr. Urlacher, Vlada B. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die Immobilisierung von Biokatalysatoren ist ein wichtiges Instrument für die kosteneffiziente Nutzung von Enzymen, da hierdurch sowohl ihre Wiederverwendung als auch verschiedenste Reaktionskonzepte ermöglicht werden. Die derzeitig verfügbaren Methoden sind jedoch kaum generell anwendbar und die Bildung einer gerichteten, vorzugsweise kovalenten Bindung des Enzyms an das Trägermaterial unter Erhaltung der katalytischen Aktivität ist eher selten. Außerdem können derzeit Immobilisate mit hoher Reinheit meist nur durch vorhergehende chromatographische Reinigung der Enzyme hergestellt werden, was mit einem hohen Zeit- und Kostenaufwand verbunden ist. Daher wurden in dieser Arbeit Tag-basierte Methoden als einfache und kostengünstige Alternative für die Immobilisierung von Enzymen evaluiert. Hierfür wurden Enzyme aus den Familien der ThDP-abhängigen Enzyme, Alkoholdehydrogenasen, Transaminasen sowie Aldolasen als Modellenzyme ausgewählt. Unter den ausgewählten Tags ermöglicht der HaloTagTM eine kovalente Bindung an Trägermaterialien, auf denen entsprechende Chloroalkane exponiert sind. Der Tag ist kommerziell erhältlich und wurde artifiziell durch entsprechende Modifizierung des aktiven Zentrums einer Dehalogenase aus Rhodococcus spec. konstruiert. Die Fusion dieses Tags mit den entsprechenden Modellenzymen ergab in allen Fällen eine gute heterologe Produktion mit bis zu 50 % Anteil am löslichen Gesamtproteingehalt. Des Weiteren ermöglicht der HaloTagTM eine schnelle Bindung der Fusionsenzyme direkt aus Rohzellextrakten an die Trägermatrix, was zu Immobilisaten mit hoher Enzymreinheit führte. Alle Modellenzyme waren im Anschluss katalytisch aktiv, wobei die Aktivität im Vergleich zu den freien Referenzenzymen ohne HaloTagTM zwischen 10 % und 100 % variierte. Für die Mehrzahl der untersuchten Enzyme wurde jedoch eine Restaktivität höher als 50 % beobachtet und im Falle der immobilisierten Aldolase konnte die Aktivität durch Auswahl von langen, starren Abstandshaltern, die den HaloTagTM mit dem Modellenzym verknüpften, erhöht werden. Die so hergestellten Immobilisate wurden im Anschluss sowohl für die Rezyklierung in Satzreaktoren als auch für die Etablierung von kontinuierlichen Reaktionen verwendet. Hierfür wurden effiziente Protokolle entwickelt, die eine direkte Beladung von Strömungsrohr-Reaktoren im Fluss erlauben, sodass Reaktionen direkt im Anschluss durchgeführt werden können. Mithilfe dieser Reaktionskonzepte wurde die effiziente Produktion von beispielsweise Mono-Aldol Reaktionsprodukten oder die Bildung von chiralen Alkoholen ermöglicht. Insbesondere wurden dadurch aber auch erfolgreich Mehrschritt-Reaktionen etabliert, da durch die räumliche Trennung der einzelnen Reaktionsschritte auftretende Inkompatibilitäten erfolgreich überwunden wurden. Dies mündete schließlich in Reaktionen für die Synthese von chiralen Epoxiden oder vicinalen Diolen, für die Raum-Zeit Ausbeuten von bis zu 1,8 kg*L-1*d-1 erzielt wurden. Die einzelnen Reaktionen verliefen darüber hinaus bis zu mehrere Wochen stabil. Im Vergleich dazu wurden Kohlenhydrat-Binde Module (CBMs), welche die Bindung an unlösliche Kohlenhydrate ermöglichen, ebenfalls erfolgreich für die Immobilisierung von Enzymen mit gleichzeitiger Reinigung eingesetzt. Die resultierenden Immobilisate zeigten ähnliche Restaktivitäten wie entsprechende immobiliserte HaloTagTM-Fusionsenzyme. Allerdings wurde in vielen Fällen eine geringe Produktion der Fusionsenzyme und eine geringere Reinheit sowie schwächere Bindungsstärke an Cellulose beobachtet. Daher wurde der HaloTagTM als besonders geeigneter Kandidat für die erfolgreiche Immobilisierung von Enzymen identifiziert. Generell ist diese Methode einfach durchzuführen und auf eine Vielzahl an Modellenzymen anwendbar, was damit das Potential birgt, die oftmals aufwändige Entwicklung von immobilisierten Biokatalysatoren deutlich zu beschleunigen und zu vereinfachen. Immobilization of biocatalysts is an important tool to allow the economical viable use of enzymes through efficient recycling and to establish different reaction concepts. A general methodology applicable for a broad range of enzymes and allowing stable, preferably site-directed and covalent binding to respective supports with high catalytic activity is still elusive. In addition, immobilizates with high enzyme purity can only be achieved via previous time-consuming chromatographic purification steps which drastically increase the overall costs for immobilization. Therefore, tag-based immobilization concepts were evaluated in this thesis as a simple and generic strategy to mediate site-directed immobilization of enzymes. To evaluate the different tags, various model enzymes were selected comprising the groups of ThDP-dependent enzymes, alcohol dehydrogenases, transaminases as well as aldolases. Among the selected tags, the HaloTagTM mediates covalent binding to carriers exposing chloroalkane residues. This tag is commercially available and was artificially constructed based on a dehalogenase from Rhodococcus spec. by respective modification of the active site. The fusion of this tag to the selected model enzymes revealed in all cases good heterologous production with up to 50 % of the soluble total protein content. Second, immobilization proceeded in all cases with high affinity within minutes directly from crude cell extracts yielding covalently bound enzymes with high purity. The residual activity of the immobilized fusion enzymes ranged between 10 % and 100 % compared to the free enzyme variants without HaloTagTM but the majority of immobilized enzymes revealed catalytic activities higher than 50 %. In addition, low residual activity of immobilized aldolases was slightly enhanced by long rigid spacer sequences separating the HaloTagTM and the corresponding model enzyme. Besides recycling in repetitive batch reactions, the applicability and long-term usage of the immobilized HaloTagTM fusion enzymes were successfully demonstrated in continuous reactions employing plug-flow reactors. Respective reactors were directly loaded in flow due to the high affinity of the HaloTagTM and reactions were started immediately afterwards. This allowed access to valuable products such as mono aldol reaction products or chiral alcohols but most importantly, multi-step reaction sequences were successfully implemented. Incompatibilities of individual steps in such cascades were successfully overcome since each step occurred in specific flow modules under optimal conditions. As a consequence, highly productive reactions were established for the synthesis of chiral epoxides and chiral vicinal diols, respectively, with space-time yields of the individual steps up to 1.8 kg*L-1*d-1 and an operational stability up to several weeks. In comparison, the use of carbohydrate-binding modules (CBMs) which mediate binding towards insoluble carbohydrates also enabled one-step purification and immobilization of the selected model enzymes with similar residual activities. However, the heterologous production of corresponding fusion enzymes was in many cases drastically reduced and a lower purity as well as a lower binding strength to respective carriers was observed. Therefore, the HaloTagTM was identified as the most suitable candidate. This methodology is simple and broadly applicable to various enzymes and consequently has the potential to facilitate the development of immobilized biocatalysts.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Sonstige Einrichtungen/Externe » Institute in Zusammenarbeit mit der Heinrich-Heine-Universität Düsseldorf » Institut für Biotechnologie, Forschungszentrum Jülich GmbH
Dokument erstellt am:	20.07.2018
Dateien geändert am:	20.07.2018
Promotionsantrag am:	17.04.2018
Datum der Promotion:	12.07.2018