Dokument: Reactive Oxygen Species and Redox-relevant Enzymes as Regulators of the Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells

Titel:	Reactive Oxygen Species and Redox-relevant Enzymes as Regulators of the Osteogenic Differentiation of Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells
Weiterer Titel:	Reaktive Sauerstoff Spezies und Redox-relevante Enzyme als Regulatoren der Osteogenen Differenzierung von Human Mesenchymalen Knochenmarksstammzellen
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46467
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180717-091313-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Strangmann, Dana-Chantal [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 9,18 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 10.07.2018 / geändert 10.07.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Suschek, Christoph V. [Gutachter] Prof. Dr. Heise, Henrike [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Pathologische Veränderungen der Knochenheilung führen zu schwerwiegenden Knochendefekten. Jegliche Störungen während der Reifungs- und Differenzierungsabläufe von MSCs führen zu Mängeln im Rahmen der Knochenhomöostase. Aufgrund des breiten Differenzierungspotentials von MSCs sind diese vielversprechenden Zellen die Quelle der Knochenbildung. Um krankhafte Knochenheilungsstörungen wie Osteogenesis imperfecta, Hypophosphatasie, Osteoporose und Osteoarthritis zu behandeln, wurden MSCs zunehmend für verschiedene therapeutische Ansätze in der regenerativen Medizin relevant. Zellalterungsprozesse sind verantwortlich für Veränderungen der ROS Konzentrationen, der Zellproliferations- und -differenzierungskapazitäten, der Zellmorphologie, der Telomeraseaktivität, des Energiestoffwechsels und der Konzentrationen von Runx2, FOXOs und p53. Reaktive Sauerstoffspezies werden aus Sauerstoff gebildet und stellen wichtige regulatorische Second Messenger bei zellulären Signalprozessen dar. Während geringe Mengen an ROS erforderlich sind, um Signalwege der Zelle während der Proliferation oder der osteogenen Differenzierungsprozesse zu regulieren, können erhöhte Spiegel zur Adipogenese führen. Diese verstärkte adipogene Differenzierung hat eine Verfettung der Knochen und damit eine beeinträchtigte Knochenhomöostase zur Folge. Weiterhin können stark erhöhte ROS-Konzentrationen apoptotische Signalwege einleiten und damit über den ausgelösten Zelltod ebenfalls zu Knochenheilungsstörungen führen. Aus diesem Grund gewinnen Ansätze zur Regulation des ROS Gleichgewichts und den damit in Verbindung stehenden gesunden Knochenheilungsprozessen, pro- und antioxidative Enzymsysteme an Bedeutung. In früheren Versuchen der osteogenen Differenzierung wurden sowohl reguläre als auch osteogen dysfunktionale hBMSCs beobachtet – sogenannte Responder oder Low Responder hBMSCs. Bemerkenswerterweise konnte durch die Zugabe des antioxidativen Enzyms Katalase das osteogene Differenzierungspotential der Low Responder humaner adipogener Stromazellen wiederhergestellt werden. Aufgrund dieser Erkenntnis wurden die Auswirkungen von Katalase ebenfalls im Rahmen der osteogenen Differenzierung der hBMSCs getestet. Wir beobachteten, dass die antioxidative Behandlung mit Katalase auch hier zu einer Wiederherstellung des osteogenen Differenzierungspotentials von Low Responder Zellen führt. Da Katalase für den chemischen Abbau von Wasserstoffperoxid zu Wasser und Sauerstoff bekannt ist, wurde der Fokus auf die Untersuchungen der Katalase spezifischen antioxidativen Effekte während der osteogenen Differenzierung gelegt. Aus diesem Grund wurde das Ausmaß der osteogenen Differenzierung durch die Bestimmung der Matrixbildung, der Aktivität der alkalischen Phosphatase und der Genexpression von Matrixproteinen, wie SPARC und Typ 1 Kollagen, in Abhängigkeit von der Zugabe verschiedener antioxidativer Zusatzstoffe untersucht. Diese Ergebnisse wurden zusätzlich mit dem Wiederherstellungspotential der Katalase verglichen. Lediglich MnSOD, Hämoglobin und Thymol zeigten eine leichte Optimierung des osteogenen Differenzierungspotentials. Keines der Zusätze zeigte jedoch ein vergleichbares osteogenes Wiederherstellungspotential wie die Katalase. Hierbei ist es wichtig anzumerken, dass ROS über verschiedene chemische Reaktionen reduziert wird, allerdings die verwendeten antioxidativen Zusätze nicht in der Lage sind Wasserstoffperoxid abzubauen. Die Auswirkungen des Zusatzes von Katalase auf die Expression von antioxidativ relevanten Proteinen wie NOX4, SOD1 / 2, FOXO1, Nrf2, GPX und Katalase wurden ebenfalls untersucht. Weiterhin wurde die Expression von Apoptose-regulierenden Proteinen wie p53 und Akt bestimmt. Interessanterweise zeigten GPX, Katalase, Akt, Nrf2 und NOX 4 ähnliche Expressionsmuster. Die Zugabe von Katalase während der osteogenen Differenzierung von Responder und Low Responder hBMSCs führte bei den oben erwähnten Proteinen zu reduzierten Expressionsraten. Unterschiede zwischen den Responder und Low Responder Donoren konnten nicht beobachtet werden. Diese fehlenden Unterschiede unterstreicht, dass das Wiederherstellungspotential der Katalase wahrscheinlich nicht über die untersuchten Proteine reguliert wird. Im Folgenden konnte zusätzlich gezeigt werden, dass Katalase, aber auch inaktivierte Katalase in der Lage sind, das beeinträchtigte osteogene Differenzierungspotential von Low Responder Donoren wiederherzustellen. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der antioxidative Reaktionsmechanismus nicht der Schlüsselweg für den Wiederherstellungsmechanismus ist. Untersuchungen der Viabilität und der Apoptoserate der Zellen ergaben keine weiterführenden Erkenntnisse, sodass die Bedeutung des Eisens als Zentralion des aktiven Zentrums der Katalase genauer untersucht wurde. Da auch beim Inaktivierungsprozess der Katalase keine Zerstörung des Eisenions erfolgt, würde es auch die positive Wirkung der inaktivierten Katalase auf die osteogene Differenzierung erklären. Bemerkenswerterweise stellen Eisensulfat und Eisenchlorid die beeinträchtigte osteogene Differenzierung in gleichem Maße wieder her wie Katalase. Darüber hinaus ist die Zugabe von Eisensulfat in der Lage das osteogene Differenzierungspotential von Responder hBMSCs zu verringern, was der mutmaßlichen zytotoxischen Wirkung von erhöhten Eisenkonzentrationen zugeschrieben werden könnte. Interessanterweise wird sowohl Eisen als auch Katalase als potenzieller Produzent von Hydroxylradikalen diskutiert. Hydroxylradikale sind für ihre ausgeprägte Reaktivität bekannt. Die Ergebnisse der Messung der Hydroxylradikalmenge zeigen, dass diese Hypothese eine sinnvolle Erklärung für das Wiederherstellungspotential von Katalase und inaktiver Katalase sein könnte, da die inaktive Katalase auch Hydroxylradikale erzeugen könnte. Da sich die Auswirkungen auf die Expression der untersuchten Proteine durch Zugabe von Eisensulfat oder -chlorid von den Ergebnissen nach einer Katalase-Behandlung unterscheiden, sind weitere vergleichende Untersuchungen nötig. Aufgrund des Wiederherstellungspotentials von Eisenionen bei der osteogenen Differenzierung wurde die Wirkung der Behandlung mit Katalase bzw. Eisenverbindungen auf die Proteinexpression von Aconitase 1 und 2 untersucht. Im Rahmen der beiden Isoformen der Aconitase ist Eisen ein relevanter Regulator des Citratzyklus, der wiederum einerseits die Citratkonzentration, eine relevante Verbindung der Knochenmatrix, und andererseits die Energiegewinnung in Form von ATP reguliert. Da diese und auch weitere Untersuchungen des Energiestoffwechsels keine Hinweise in die eine oder andere Richtung ergaben, erscheint die Regulation des osteogenen Wiederherstellungspotentials durch die Hydroxylradikalgenerierung weiterhin sinnvoll. Um diese Hypothese weiter zu untermauern, sind allerdings weitere Untersuchungen erforderlich. Die Katalase-Behandlung von osteogen dysfunktionalen MSCs könnte schließlich ein vielversprechender therapeutischer Ansatz im Rahmen der regenerativen Therapien von Knochenheilungsstörungen werden. Bone defects are one of the most serious pathologies. Any disturbances during the maturation and differentiation processes of MSCs lead to deteriorations of the bone healing processes. Due to the wide-ranging differentiation potential of MSCs, these promising types of cells are the source of bone healing processes. Therefore, MSCs became relevant for diverse therapeutical approaches within the regenerative medicine to treat bone healing disorders such as osteogenesis imperfecta, hypophosphatasia, osteoporosis and osteoarthritis. Cell aging processes are responsible for alterations of ROS levels, cell proliferation and differentiation capacities, cell morphology, telomerase activity, energy metabolism and levels of Runx2, FOXOs and p53. Interestingly, oxygen can form reactive oxygen species which constitute important regulatory second messenger during cell signaling processes. As low levels of ROS are required to regulate cell signaling pathways during proliferation or osteogenic differentiation processes, elevated levels can result in adipogenic differentiation proceedings which lead to obesity and consequently to impaired bone remodeling and thus bone defects. Higher ROS concentrations are harmful and can also cause cell death and apoptosis which also result in bone healing disorders. For that reason, approaches to regulate a balance between the formation and degradation of ROS and thus healthy bone healing processes, pro- and antioxidant enzymatic pathways are gaining in importance. In previous osteogenic differentiation investigations, regular as well as osteogenically dysfunctional hBMSCs were observed. Remarkably, the addition of the antioxidative enzyme catalase could restore the impaired osteogenic differentiation potential of osteogenically dysfunctional – so called low responder – human adipogenic stromal cells. Therefore, the effects of catalase were also tested on hBMSCs. We observed that the catalase treatment also resulted in a restoration of osteogenically dysfunctional hBMSCs. Since catalase is known for the chemical degradation of hydrogen peroxide to water and oxygen, we focused on investigations of its antioxidative effects during the osteogenic differentiation. For that reason, the osteogenic differentiation dimension was assessed by the determination of the extent of matrix calcification, the alkaline phosphatase activity and the gene expression of matrix proteins, such as SPARC and type 1 collagen, depending on the addition of diverse antioxidative additives and compared to the restoration potential of catalase. Only MnSOD, hemoglobin and thymol showed a slight increase of the osteogenic differentiation potential. Nonetheless, no additive showed a comparable osteogenic restoration potential as catalase. In this case, it is important to note that all used additives cannot degrade hydrogen peroxide but reduce ROS levels via diverse chemical reactions. The impact of catalase addition on the protein expression of antioxidative relevant proteins such as NOX4, SOD1/2, FOXO1, Nrf2, GPX and catalase were also assessed. Furthermore, the expression of apoptosis regulating proteins such as p53 and Akt were determined. GPX, catalase, Akt, Nrf2 and NOX 4 showed similar expression patterns. The addition of catalase during the osteogenic differentiation of responder and low responder cells resulted in reduced expressions of the previously mentioned proteins. Differences between the expressions of responder and low responder cells could not be observed which emphasizes that the restoration potential of catalase is not regulated via the investigated proteins. In the following, the test results highlighted that catalase but also inactivated catalase can restore the impaired osteogenic differentiation potential of low responder cells. These outcomes suggest that the antioxidative reaction mechanism is not the key pathway for the restoration mechanism. Since investigations of the cell viability and apoptosis rates showed no further indications, the additions of iron compounds were analyzed. Iron is the central ion of the active center of catalase and might be the reason for the restoration potential of catalase and inactivated catalase since the inactivation process does not destroys the iron ion. Remarkably, iron sulfate and iron chloride restore the impaired osteogenic differentiation to an equal extent as catalase does. Furthermore, the addition of iron sulfate can decrease the osteogenic differentiation potential of responder cells which might be caused by the cytotoxic effect of elevated iron concentrations. Interestingly, iron as well as catalase are discussed as potential producers of hydroxyl radicals. Hydroxyl radicals are known for their rigidly reactivity. The measurement of the hydroxyl radical amount indicates that this hypothesis might be a reasonable explanation for the restoration potential of catalase and inactive catalase because the inactive catalase might also produce hydroxyl radicals. Since the impacts on the expression of the investigated proteins by adding iron sulfate or chloride are differing to the results after a catalase treatment, further comparing investigations are obligatory. Due to the restoration potential of iron ions on the osteogenic differentiation, the effects of the treatment with catalase or rather iron compounds on the protein expression of aconitase 1 and 2 were analyzed. Via the two isoforms of aconitase, iron is a relevant regulator of the citrate cycle which in turn regulates the citrate concentration, a relevant compound of the bone matrix, and also the energy generation in form of ATP. As these investigations and further tests of the energy metabolism showed no indications in one direction or the other, the regulation of the osteogenic restoration potential by the hydroxyl radical generation seems reasonable. To verify these hypotheses, further investigations are required. Nonetheless, the catalase treatment of osteogenically dysfunctional MSCs might be a promising therapeutical approach in regenerative therapies of bone healing disorders.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	17.07.2018
Dateien geändert am:	17.07.2018
Promotionsantrag am:	16.05.2016
Datum der Promotion:	09.07.2018