Dokument: Identifizierung und Epidemiologie von Pilzerregern bei immunsupprimierten Patienten mittels moderner molekularbiologischer Methoden
| Titel: | Identifizierung und Epidemiologie von Pilzerregern bei immunsupprimierten Patienten mittels moderner molekularbiologischer Methoden | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46413 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20180710-100541-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Rahn, Sebastian [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Pfeffer, Klaus [Gutachter] Prof. Dr. Kalscheuer, Rainer [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibung: | In dieser Arbeit wurde mit der fuPCR ein neuartiger Realtime-PCR-Assay entwickelt und für die schnelle Identifikation und Differenzierung von invasiven Pilzen in immunsupprimierten Patienten mit hämatologischen Erkrankungen getestet.
Als Zielregion für die fuPCR wurde das ITS2-Segment (internal transcribed spacer 2) des ribosomalen Genclusters ausgewählt. Insgesamt wurden 1521 verschiedene ITS1-ITS2-Sequenzen von 71 Pilzspezies im Rahmen einer umfassenden Datensammlung aus Datenbanken selektiert. Diese Sequenzen bildeten in einem multiplen Sequenzalignment die Grundlage für den Entwicklungsprozess von 16 familien- und zweigspezifischen Forwardprimern für die sieben pilzdifferenzierenden Multiplexreaktionen des fuPCR-Assays in Kombination mit dem universellen ITS4.2-Reversprimer. Mithilfe isolierter Pilz-DNA von Referenzstämmen wurde die Funktionalität der einzelnen PCR-Reaktionen, A - G, validiert. Die sieben Reaktionen der fuPCR ermöglichen als „First Line“-PCR den Nachweis der 13 medizinisch relevanten Pilz-Genera Aspergillus & Penicillium (Reaktion A); Absidia, Cunninghamella & Lichtheimia (Reaktion B); Mucor, Rhizomucor & Rhizopus (Reaktion C); Fusarium & Scedosporium (Reaktion D); Cryptococcus (Reaktion E); Trichosporon (Reaktion F) und Candida (Reaktion G). Darüber hinaus wurden für die unter hämatologischen Patienten weitverbreiteten Pilzgattungen Aspergillus und Candida jeweils vier speziesspezifische TaqMan-Sonden entwickelt (A. flavus, A. fumigatus, A. niger, A. terreus sowie C. albicans, C. dubliniensis, C. glabrata und C. krusei), die in einem nachgeschalteten „Second Line“-TaqMan-PCR-Assay die Identifizierung dieser Spezies ermöglichten und die Sangersequenzierung überflüssig machten. Die fuPCR wurde an klinischen Proben (EDTA-Blut, Blutserum und Rachenabstriche) von 50 Patienten mit schweren hämatologischen Erkrankungen und 30 gesunden Individuen getestet. Anfänglich wurden 198 Proben von immunsupprimierten Patienten mit der neuartigen fuPCR untersucht. Dabei wurden 50,8 % (33/65) der Rachenabstriche, 4,8 % (3/63) der EDTA-Blutproben und 1,4 % (1/70) der Blutserum-Proben positiv getestet. Anschließend wurden 56 Rachenabstriche von immunsupprimierten Patienten und 30 gesunden Individuen vergleichend mittels fuPCR und mikrobiologischer Standardkultivierung analysiert. Durch beide Methoden übereinstimmend wurden 30,4 % (17/56) der Rachenabstriche von immunsupprimierten Patienten positiv und 37,5 % (21/56) negativ getestet. 32,1 % (18/56) der Rachenabstriche wurden positiv durch die fuPCR und zeitgleich negativ durch die Kultivierung getestet. Bei einer Analyse der Blutproben der immunsupprimierten Patienten wurden 5,4 % (3/56) des EDTA-Bluts und 16,1 % (9/56) des Blutserums positiv durch die fuPCR getestet. Alle analysierten Proben der 30 gesunden Probanden waren fuPCR-negativ. Bei Betrachtung des Keimspektrums gehörten 38,9 % (14/36) der in den Rachenabstrichen gefundenen Pilze zu Candida spp., 47,2 % (17/36) zu Saccharomyces spp., 5,6 % (2/36) zu Cladosporium spp. und 8,3 % (3/36) zu Alternaria spp. Mittels Kultivierung konnten dahingegen nur Candida spp. (10/17) und Saccharomyces spp. (7/17) in den Rachenabstrichen identifiziert werden. Bei Betrachtung der Anamnese der immunsupprimierten Patienten wurde ersichtlich, dass 5 von 14 Patienten (35,7 %) mit fuPCR-positiv getesteten Blutproben eine gemäß der EORTC/MSG-Kriterien mögliche fungale Pneumonie aufwiesen. Diese Arbeit umfasst einen systematischen, methodenbasierten Ansatz für die Detektion von Pilzen (fuPCR) bei hämatologischen Patienten und kann in ihrem Umfang jederzeit für andere relevante Pilze angepasst und um diese erweitert werden. Bei einem Vergleich mit der als Goldstandard geltenden Kultivierung lieferte die fuPCR überlegene Resultate: Die Ergebnisse der fuPCR-Analysen waren schneller verfügbar, sie waren sensitiver und lieferten eine sofortige Identifikation der Pilzgruppe. Die fuPCR trägt somit ein großes Potential in sich und kann ein wertvolles diagnostisches Werkzeug für die schnelle Detektion von Pilzinfektionen bei Hochrisikopatienten sein. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Medizinische Mikrobiologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 10.07.2018 | |||||||
| Dateien geändert am: | 10.07.2018 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 01.03.2018 | |||||||
| Datum der Promotion: | 02.07.2018 |
