Dokument: Nrf2 as a converging node of redox sensing and signaling in HUVECs induced by (-)-epicatechin, nitric oxide, sulfide and nitrosopersulfide

Titel:	Nrf2 as a converging node of redox sensing and signaling in HUVECs induced by (-)-epicatechin, nitric oxide, sulfide and nitrosopersulfide
Weiterer Titel:	Nrf2 als Knotenpunkt der RedOx Wahrnehmung und Reaktion in HUVECs induziert durch (-)-Epicatechin, Stickstoffmonoxid, Sulfid, und Nitrosopersulfid
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46382
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180703-102425-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Pullmann, David [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 1,28 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.07.2018 / geändert 03.07.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Dr. rer. nat. Cortese-Krott, Miriam [Gutachter] Prof. Dr. Stahl, Wilhelm [Gutachter]
Stichwörter:	Nrf2, redox, oxidative stress, HUVECs, epicatechin, nitric oxide, sulfide, nitrosopersulfide
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Hintergrund Der durch oxidativen Stress induzierte Nrf2 Signalweg vermittelt die Expression von antioxidativen Phase II Enzymen. Daher spielt Nrf2 eine entscheidende Rolle beim Schutz eukaryotischer Zellen vor oxidativen oder elektrophilen Schäden, die zu zellulärer Dysfunktion führen können und damit zur Pathogenese vieler Krankheiten beitragen. Da elektrophile Substanzen in der Lage sind Nrf2 zu aktivieren ist es von großem Interesse, ob die Keap1/Nrf2 Interaktion auch in menschlichen Endothelzellen ein gemeinsames molekulares Ziel dieser Substanzen ist und einen Knotenpunkt bei der Wahrnehmung und Antwort von elektrophilem und oxidativen Stress darstellt und somit zur Aufrechterhaltung der zellulären Redox Homöostase in humanen Endothelzellen beiträgt. Ziel Die Ziele dieser Dissertation waren demnach den Einfluss von (1) (-)-Epicatechin, (2) NO˙, NOˉ und NO+, (3) Sulfid, (4) einem Wechselspiel von NO und Sulfid und (5) deren vor kurzem beschrieben Reaktionsprodukts SSNOˉ auf die Aktivierung und Translokation von Nrf2 und die Expression der Phase II Enzyme zu untersuchen und zwar in einem direkten Vergleich im selben zellulären Modell (human umbilical vein endothelial cells – HUVECs). Methoden HUVECs wurden mit den jeweiligen Substanzen in Medium mit 2% inaktiviertem FCS behandelt. Nach 1 h wurde die Nrf2 Translokation und Bindungsaktivität an das Antioxidative Responsive Element (ARE) durch Transkriptionsfaktor-Assays und Western-Blots von Kernextrakten bestimmt. Die Genexpression der antioxidativen Phase-II Enzyme Hmox1, NQO1 und GCLC wurden unter Verwendung der reverse transcription real time PCR bestimmt. Zelluläre Glutathion Konzentrationen wurden mit Fluoreszenznachweismethoden analysiert. Die Entstehung des Reaktionsproduktes von NO und Sulfid (SSNOˉ) wurde mittels UV-sichtbarer-Spektrometrie gemessen. Ergebnisse 1) die Nrf2 Bindungsaktivität von HUVECs war nach Behandlung der Zellen mit 10μM (-)-Epicatechin signifikant auf das 1.48 ±0.09 fache erhöht wohingegen die Gen Expression von Hmox1, Nqo1 und Gclc nur geringfügig beeinflusst wurde. (2) Behandlung mit 1-100 μM NO˙, NO- und NO+ Donoren zeigte, dass NO˙ (aus SPER/NO freigesetzt) sowohl die Nrf2 Bindungsaktivität (2.05 ±0.1 fach bei 100 μM) als auch die Hmox1 Genexpression (16.26 ±1.97 fach bei 20 μM) am stärksten beeinflusst während seine Redox Varianten NOˉ und NO+ nur geringeren jedoch trotzdem signifikanten Einfluss hatten. (3) Der Sulfid Donor Na2S erhöhte die Nrf2 Bindungsaktivität nur bei Konzentrationen von über 100 μM signifikant (1.43 ±0.14 fach bei 200 μM¸ 2.25 ±0.27 fach bei 400 μM) während GYY 4137 in mikromolaren Konzentrationen keinen signifikanten Effekt auf Nrf2 hatte. (4) Das Zusammenspiel von Sulfid und NO zeigte unterschiedliche Ergebnisse. Währen die Nrf2 Aktivierung durch den NO+ Donor S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP) von Sulfid abgeschwächt wurde, hatte die Co-Incubierung von Sulfid und SPER/NO keinen eindeutigen Effekt. (5) Die Behandlung von HUVECs mit begastem SSNOˉ führte zur stärksten, signifikanten Nrf2 Aktivierung (1.76 ±0.28 fach bei 20 μM, 2 ±0.42 fach bei 40 μM) und Hmox1 Expression (10.68 ±1.31 fach bei 20 μM) unter allen untersuchten Substanzen. Es konnte gezeigt werden, dass die Freisetzung von NO˙ und Entstehung von Polysulfiden durch den Zerfall von SSNOˉ wesentlich zu den SSNOˉ induzierten Effekten auf den Nrf2 Signalweg beitragen, da nach gemeinsamer Incubierung mit dem NO Scavenger (cPTIO) und nach Zerfall der Polysulfide durch Anwesenheit von millimolarem Cystein die Nrf2 Bindungsaktivität deutlich geschwächt wurde. 8 Fazit Zum ersten Mal wurden die Effekte elektrophiler Substanzen auf den Nrf2 Signalweg und die Gen Expression von Phase II Enzymen im selben zellulären Model verglichen, indem HUVECs mit (-)-Epicatechin, NO˙, NO- und NO+, Sulfid und dem Reaktionsprodukt aus NO und Sulfid (SSNOˉ, SULFI/NO, Polysulfide) behandelt wurden. Hierbei konnte diese Arbeit zeigen, dass unter allen untersuchten Substanzen NO˙ und SSNOˉ die stärksten Effekte auf den Nrf2 Signalweg hatten, wobei diese Effekte sehr wahrscheinlich durch die Zerfallsprodukte NO˙ und S2˙ˉvermittelt werden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass diese beiden Substanzen eine Schlüsselrolle in der Redoxkommunikation spielen könnten. Deshalb sollten sie in weiteren Studien zum Zusammenspiel von NO und Sulfid eingehend untersucht werden. Background Oxidative and electrophilic stress-induced Nrf2 signaling mediates the expression of antioxidant and phase II detoxifying enzymes via binding to the antioxidant response element (ARE). Therefore, Nrf2 plays a crucial role in mammalian cell protection from oxidative and electrophilic insults, which cause cellular dysfunction. Since electrophilic agents are capable of activating Nrf2 it is of great interest weather Keap1-Nrf2-interaction is a common target of these molecules in human endothelial cells and hereby acts as a converging node of sensing electrophilic and oxidative stress and of maintaining cellular redox homeostasis. Aims The aim of this dissertation was to elucidate and compare the effects of the electrophiles (1) (-)-epicatechin, (2) NO˙, NOˉ and NO+, (3) sulfide, (4) the crosstalk of NO and sulfide and (5) their recently described reaction product SSNOˉ on Keap1-Nrf2-interaction in the same cellular model (human umbilical vein endothelial cells – HUVECs). Methods HUVECs were treated with the substances in micromolar concentrations in medium containing 2% inactivated FCS. Nrf2 translocation into the nucleus and binding to ARE was detected by transcription factor binding assays. Additionally, western blots of nuclear extracts were performed. Transcription of phase II antioxidant enzymes (Hmox1, Nqo1 and Gclc) was determined using reverse transcription real time PCR. The formation of reaction products of nitric oxide and sulfide (SSNOˉ) was measured via UV-visible spectrometry. Results 1) Nrf2 binding activity of HUVECs was significantly increased (1.48 ± 0.09 fold) upon incubation with 10μM (-)-epicatechin, whereas gene expression of Hmox1, Nqo1 and Gclc was only little affected. (2) Treatment with 1-100 μM concentrations of NO˙, NO- and NO+ donors showed that NO˙ (released by SPER/NO) increased ARE binding (2.05 ±0.1 fold at 100 μM) and Hmox1 gene expression (16.26 ±1.97 fold at 20 μM) most potently while the other two redox congeners had weaker but still significant effects. (3) The sulfide donor Na2S only exerted significant effects on Nrf2 activation when concentrations were higher than 100 μM (1.43 ±0.14 fold at 200 μM¸ 2.25 ±0.27 fold at 400 μM) while GYY 4137 had no significant effects at micromolar concentrations. (4) Crosstalk of NO and sulfide led to diverging results. While the Nrf2 activiation of the NO+ donor S-nitroso-N-acetylpenicillamine (SNAP) was attenuated by sulfide, co-incubation with sulfide did not affect SPER/NO derived Nrf2 activation. (5) Treatment of HUVECs with SSNOˉ led to the strongest and most significant activation of Nrf2 (1.76 ±0.28 fold at 20 μM, 2 ±0.42 fold at 40 μM) and transcription of Hmox1 mRNA (10.68 ±1.31 fold at 20 μM) among all substances analyzed. Upon coincubation with NO scavengers (cPTIO) and after decomposition of polysulfides (upon coincubation with cysteine) Nrf2 binding activity and Hmox1 gene expression were significantly decreased indicating that NO release and polysulfides contribute to Nrf2 activation of the SSNOˉ mix. Conclusion For the first time Nrf2 activation, translocation and transcription of phase II detoxifying enzymes was directly compared in the same cellular model (HUVECs) after treatment with (-)-epicatechin, NO˙, NO- and NO+, sulfide and reaction products of NO and sulfide (SSNOˉ, SULFI/NO, polysulfides). Taken together this study showed that among all substances under investigation NO˙ and SSNOˉ exert the most distinct effects on Nrf2 signaling, whereas effects of SSNOˉ are likely to be mediated by its products of homolysis NO˙ and S2˙ˉ of which the later results in formation of polysulfides. Therefore, these molecules emerge to play a key role in redox signaling and should be subject to subsequent studies.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	03.07.2018
Dateien geändert am:	03.07.2018
Promotionsantrag am:	28.11.2017
Datum der Promotion:	19.06.2018