Dokument: Characterization of Nisin-regulating NisR and Nisin-modifying NisC from Lactococcus lactis

Titel:	Characterization of Nisin-regulating NisR and Nisin-modifying NisC from Lactococcus lactis
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46381
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180703-103529-3
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Dr. Zhang, Siai [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 15,62 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.07.2018 / geändert 02.07.2018
Beitragender:	Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Lantibiotics are ribosomally synthesized and posttranslationally modified peptide (RiPPs) antibiotics. Nisin (NisA), produced by Lactococcus lactis, is a 34-residue long peptide and contains five cyclic thioether rings which have been proven to be crucial for activity. The precursor of nisin was initially biosynthesized from ribosome and later on further processed by a series of maturation steps to achieve a fully functional nisin molecule. The biosynthesis process is regulated via a two-component system, consisting of a histidine kinase (NisK) and a response regulatory protein (NisR). And for the later-on maturation process, five lanthionine rings are installed by a two-step process that first involves dehydration (NisB) of Ser and Thr residues to the corresponding dehydroalanines and dehydrobutyrines, followed by regioselective addition (NisC) of C-terminal Cys residues to the dehydroamino acids. The NisK/NisR two-component machinery can regulate not only the biosynthesis of Nisin; in the Nisin-controlled gene expression system (NICE), it is also used for heterologous protein expression. To perform a thorough study on this pathway, both of the proteins are required. In this work, NisR was successfully expressed in E. coli, purified and proved to be homogeneous at both, pH 9 and pH 11. As a regulatory protein, its binding affinity was verified through electrophoretic mobility shift assay. Additionally, a series of crystallization trials were performed on NisR. On the other hand, due to the fact that peptides are usually vulnerable to the acid-mediated hydrolysis and proteolytic degradation, their applications for therapeutic and industrial purpose are highly restricted. The thioether installing enzymes, such as NisC, on the other hand, has been demonstrated of stabilizing a broad range of peptides by introducing thioether bridges. Thus, with a goal of improving the feasibility of designing novel peptides with high bioavailability, obtaining the structural information of NisC in complex with NisA (AC complex) is considered to be the most straightforward way for understanding the mechanism of cyclization. Both co-crystallization and soaking were used to obtain the crystal of AC complex. Meanwhile, crystals of NisC in complex with phosphoenol pyruvate were obtained and the structure was solved by X-ray crystallography. The structure revealed PEP located in the active site of NisC, being anchored by His212, and was therefore suggested to be an activating agent for NisC modification reaction. Lantibiotica sind ribosomal synthetisierte und posttranslational modifizierte Peptidantibiotika (RiPPs). Nisin (NisA) wird vom Bakterium Lactococcus lactis produziert und ist 34 Aminosäuren lang. Es enthält fünf Thioetherringe, die für die antimikrobielle Aktivität verantwortlich sind. Die Nisin Vorstufe wird initial am Ribosom synthetisiert und durchläuft mehrere Reifungsprozesse bis es seine biologisch aktive Form erreicht hat. Der Biosynthese-Prozess wird von einem zwei Komponenten System kontrolliert, bestehend aus der Histidin Kinase (NisK) und dem Regulator (NisR). Im Laufe der Reifung werden durch die Dehydratase NisB die Serin- und Threoninreste im Kernpeptid dehydratisiert, wodurch die korrespondierenden Aminosäuren Didehydroalanin und Didehydrobutyrin entstehen. Danach erfolgt der regioselektive Ringschluss dieser dehydratisierten Aminosäuren mit einem C-terminalen Cysteinrest durch die Zyklase NisC. Das NisK/NisR zwei Komponenten System reguliert nicht nur die Biosynthese von Nisin. Im Nisin-controlled gene expression system (NICE) dient es auch der Expression heterologer Proteine. Für eine umfassende Studie dieses Regulationsweges sind demnach beide Proteine notwendig. In dieser Arbeit wurde NisR erfolgreich heterolog in E. coli exprimiert und konnte bis zur Homogenität bei pH 9 und pH 11 gereinigt werden. Da es sich um ein regulatorisches Protein handelt, wurde die Bindungsaffinität zu Nisin mittels electrophoretic mobility shift assay (EMSA) verifiziert. Des weiteren wurden verschiedene Ansätze durchgeführt um NisR zu kristallisieren. Der Einsatz von Peptiden in industriellen oder therapeutischen Ansätzen ist aufgrund der sauren Hydrolyse oder dem proteolytischen Abbau eingeschränkt. Durch den Einsatz von Zyklasen, wie der Zyklase NisC, konnte gezeigt werden, dass ein breites Spektrum an Peptiden durch die Einführung von Thioetherringen eine erhöhte Stabilität aufwiesen. Das Ziel ist es durch die Verbesserung der Prozessierung neue, veränderte Substanzen mit hoher Bioaktivität zu generieren. Hierfür sind strukturelle Information über das NisA gebundene NisC (AC Komplex) wichtig, um ein besseres Verständnis für den Mechanismus der Zyklisierung zu erhalten.Es wurden sowohl Co-Kristallisationen von NisA/NisC versucht als auch später das soaking eines NisC Kristalls mit NisA. Währenddessen konnten NisC Kristalle gefunden werden, in welchen sich nach der Strukturaufklärung ein Phosphoenolpyruvat (PEP) Molekül im aktiven Zentrum von NisC befand. Dieses PEP war an der Aminosäure His212 gebunden, was impliziert, dass es einen verstärkten Effekt auf die Zyklisierung haben könnte.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Biochemie
Dokument erstellt am:	03.07.2018
Dateien geändert am:	03.07.2018
Promotionsantrag am:	18.05.2018
Datum der Promotion:	28.06.2018