Dokument: Involvement of Autophagy and Mitophagy in the Pathogenesis of Hepatic Encephalopathy

Titel:	Involvement of Autophagy and Mitophagy in the Pathogenesis of Hepatic Encephalopathy
Weiterer Titel:	Beteiligung von Autophagy und Mitophagy in der Pathogenese der hepatischen Enzephalopathie
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46351
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190814-095040-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Lu, Kaihui [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 8,19 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 02.07.2018 / geändert 02.07.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Reichert, Andreas [Gutachter] Prof. Dr. Schmitt, Lutz [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Die hepatische Enzephalopathie (HE) ist ein häufiges neuropsychiatrisches Krankheitsbild, das mit verschiedenen Formen von Leberfunktionsstörungen einhergeht. Durch erhöhte Konzentrationen von Ammoniak sowohl im Blut als auch im Gehirn charakterisiert, wird HE als das kumulative Ergebnis einer Astrozytendysfunktion angesehen, die sich aus zerebralen osmotischen Störungen und erhöhtem intrazellulärem oxidativem/nitrosativem Stress entwickelt. Jüngste Studien haben gezeigt, dass die Behandlung von kultivierten Astrozyten mit Ammoniak, einem In-vitro-Modell für HE, zu mitochondrialen Störungen wie einer Veränderung der Mitochondrienmorphologie und einem Rückgang des mitochondrialen Membranpotentials führen kann, was darauf hindeutet, dass die mitochondriale Qualitätskontrolle (mQC) an der Pathogenese der HE beteiligt ist. Die Auswirkungen von Ammoniak, dem wesentlichen Toxin der HE, auf Mitochondrien und mQC im Krankheitshintergrund der HE sind jedoch weitgehend unbekannt. Der Fokus dieser Arbeit lag auf der Untersuchung der Beteiligung von Autophagie und Mitophagie, zwei wichtigen zellulären Qualitätskontrollprozessen, an der Pathogenese von HE. Da die Dysfunktion von Astrozyten für die Pathogenese von HE von zentraler Bedeutung ist, wurde die Charakterisierung von Autophagie und Mitophagie mechanistisch durch Analyse verschiedener Marker in kultivierten Rattenastrozyten, die mit NH4Cl stimuliert wurden, durchgeführt. Die In-vivo-Relevanz wurde dann durch die Untersuchung von Ratten-Kortexproben validiert, die aus einem akuten Ammoniakintoxikationsmodell von HE erhalten wurden. Die Behandlung von Astrozyten mit niedrigen NH4Cl-Konzentrationen induzierte Autophagie, während Mengen ab 2 mM NH4Cl die Autophagie in Astrozyten zeit- und dosisabhängig hemmten. Die Charakterisierung der Autophagie-hemmenden Wirkung von Ammoniak zeigte, dass die Inhibition hauptsächlich über intrazelluläre pH-Veränderung vermittelt wurde und durch Verminderung des intrazellulären ROS-Spiegels weitgehend abgeschwächt werden konnte, während eine Hemmung der GS- oder p38MAPK-Aktivität keinen signifikanten Einfluss auf diese Inhibition hatte. Es wurde gezeigt, dass Taurin-Supplementation in der Lage ist, den Grad der Autophagie-Inhibierung in kultivierten Rattenastrozyten sowie in einem akut mit NH4Ac behandelten Rattenmodell zu verringern. Diese Autophagie-Hemmwirkung wurde auch in kultivierten Rattenastrozyten als reversibel nachgewiesen. Zusätzlich wurde gezeigt, dass TGM2, ein Gen, das die Fusion zwischen Autophagosom und Lysosom und den autolysosomalen Abbau fördert, einen erhöhten Proteinlevel in Reaktion auf Ammoniakbehandlung in kultivierten Rattenastrozyten und Gehirnproben aus einem Rattenmodell von HE zeigt. Dies weist darauf hin, dass relevante Abwehrmechanismen ausgelöst werden können, um Astrozyten vor dem Ammoniak-induzierten Stress zu schützen. In diesem Zusammenhang bemerkenswert ist das Ergebnis unserer Kooperationspartner Prof. Dr. Dieter Haüssinger und Dr. Boris Görg, welches ebenfalls eine erhöhte Menge TGM2-mRNA in der Großhirnrinde von Patienten mit HE zeigte. Es konnte gezeigt werden, dass 5 mM NH4Cl in kultivierten Rattenastrozyten mitochondriale Dysfunktion induzieren, was sich durch eine erhöhte mitochondriale Fragmentierung, ein verringertes mitochondriales Membranpotential und eine reduzierte Cristae-Zahl pro Mitochondrion äußert. Wahrscheinlich als Reaktion auf die mitochondrialen Schäden wurde ein deutlicher Anstieg der Kolokalisation zwischen TIM23 und LC3 nach Ammoniakbehandlung beobachtet, was auf eine erhöhte Mitophagie-Induktion hinweist. Dieser Anstieg wurde auch in den mit CH3NH3Cl behandelten Proben beobachtet, war jedoch in den NAC-behandelten Proben viel geringer, was darauf hindeutet, dass die durch Ammonium induzierte Mitophagie-Induktion pH-abhängig war und durch Verringerung des intrazellulären ROS-Spiegels abgeschwächt werden konnte. Eine weitere Untersuchung der Hauptwege der Mitophagie ergab, dass Ammoniak die Parkin-vermittelte Mitophagie in Astrozyten induzierte und diese Induktion stark vom pH-Wert abhängig war, da die CH3NH3Cl-Behandlung ebenfalls zu einem ähnlichen Anstieg des mitochondrial-translozierten Parkin-Signals führte. Dies ist wahrscheinlich eine direkte Folge der Stabilisierung von Volllängen-PINK1 auf der OMM. Außerdem induzierte Ammoniak auch NIX-vermittelte Mitophagie, wie durch die Akkumulation verschiedener Formen von NIX gezeigt wird. Die Induktion von NIX-vermittelter Mitophagie war auch hauptsächlich abhängig von der intrazellulären pH-Änderung, während die Verringerung des ROS-Spiegels durch NAC oder Taurin eine viel schwächere Akkumulation von NIX erreichte. Darüber hinaus haben wir entdeckt, dass Ammoniak nicht nur die Initiierung verschiedener Mitophagiewege verstärkt, sondern auch die PGC-1α-vermittelte mitochondriale Biogenese verstärkt, was die kritische Beteiligung verschiedener mQC-Mechanismen als Reaktion auf Ammoniak-induzierten Stress zeigt. Werden nachgeschaltete biologische Parameter betrachtet, so zeigt sich, dass bei 5 mM NH4Cl-Behandlung der Knockdown von Bestandteilen der Autophagie- und Mitophagie -Maschinerie die Astrozyten nicht weiter sensibilisierte. Bei sehr hohen Konzentrationen an Ammonium führte der Knockdown von Atg5 jedoch zu einer signifikanten Abnahme der Zelllebensfähigkeit und der Knockdown von Parkin, PINK1 oder NIX hatten einen geringeren Rückgang zur Folge, was darauf hindeutet, dass Autophagie und Mitophagie unter extremen Bedingungen eine überlebensnotwendige Rolle spielen. Die von uns erzielten Ergebnisse, dass ROS-verringernde Reagenzien (z. B. NAC und Taurin) die Autophagie-Hemmung durch Ammoniak in Astrozyten oder in Tiermodellen von HE zum Großteil aufheben können, betrachten wir als vielversprechenden Ansatz für mögliche Therapien. Photoaktivierbare, saure Nanopartikel (paNP) erwiesen sich auch als wirksam bei der Wiederherstellung der intrazellulären autophagischen Aktivität durch Lysosomen-Reazidifizierung in kultivierten Rattenastrozyten. Dies liegt möglicherweise an der Verbesserung der Aktivität von lysosomalen Enzymen wie Cathepsin L, was das Potenzial für neuartige nanomedizinische Therapeutika gegen HE hervorhebt. Zusammengefasst legt die hier vorgestellte Arbeit nahe, dass die Initiierung von Parkin- und NIX-vermittelter Mitophagie sowie ein unzureichender Ablauf der Autophagie an der Pathogenese von HE beteiligt sind und somit vielversprechende Ansatzpunkte für die Entwicklung zukünftiger Therapien darstellen. Hepatic encephalopathy (HE) is a frequent neuropsychiatric syndrome associated with various forms of liver dysfunction. Characterized by elevated levels of ammonia in both blood and brain, HE is proposed to be the accumulative result of astrocyte dysfunction evolving from cerebral osmotic disturbances and increased intracellular oxidative/nitrosative stress. Recent studies demonstrated that treatment of cultured astrocytes with ammonia could lead to mitochondrial dysfunction such as alteration of mitochondrial morphology and decrease of mitochondrial membrane potential, suggesting mitochondrial quality control (mQC) is involved in the pathogenesis of HE. However, the effects of ammonia, the major toxin of HE, on mitochondria and mQC in the disease background of HE remain largely unknown. The focus of this work was investigating the involvement of autophagy and mitophagy, two important cellular quality control processes, in the pathogenesis of HE. Since astrocyte dysfunction is central to the pathogenesis of HE, the characterization of autophagy and mitophagy was performed mechanistically by analyzing various markers in cultured rat astrocytes stimulated with NH4Cl. The in vivo relevance was then validated via assaying cortex samples obtained from acutely ammonia intoxicated rats. Treatment of astrocytes with low concentrations of NH4Cl induced autophagy while from 2 mM onwards, NH4Cl inhibited autophagy in astrocytes in a time- and dose-dependent manner. Characterization of the autophagy-inhibitory effect of ammonia showed that the blockage was mainly mediated via intracellular pH alteration and could be largely alleviated by decreasing the intracellular ROS level, while inhibition of GS or p38MAPK activity did not have a significant effect on this inhibition. Taurine supplement was shown to be able to decrease the degree of autophagy inhibition in cultured rat astrocytes as well as in the acute NH4Ac-intoxicated rat model. This autophagy inhibitory effect was also shown to be reversible in cultured rat astrocytes. In addition, TGM2, a gene promoting the fusion between autophagosome and lysosome as well as the autolysosomal degradation, was shown to be increased at the protein level in response to ammonia treatment in both cultured rat astrocytes and brain samples from a rat model of HE, indicating that relevant defense mechanisms may be triggered to protect the astrocytes against the ammonia-induced stress. Interesting to note, result from our cooperation partners, Prof. Dr. Dieter Haüssinger and Dr. Boris Görg, also showed an elevated TGM2 mRNA level in the cerebral cortex of patients suffering from HE. In cultured rat astrocytes, 5 mM NH4Cl was shown to induce mitochondrial dysfunction as evidenced by increased mitochondrial fragmentation, decreased mitochondrial membrane potential and reduced cristae number per mitochondrion. Likely as a reaction to the mitochondrial damage, a marked increase was observed for the colocalization between TIM23 and LC3 after ammonia treatment, indicating that there was an increased mitophagy induction. This increase was also observed in the CH3NH3Cl-treated samples but was much less in the NAC-treated samples, suggesting that ammonia-induced mitophagy induction was pH dependent and could be decreased by reducing the intracellular ROS level. Further examination of major mitophagy pathways revealed that ammonia induced Parkin-mediated mitophagy in astrocytes and this induction was largely dependent on pH as CH3NH3Cl treatment also led to a similar increase in the mitochondrial-translocated Parkin signal. This is likely a direct result of the stabilization of full-length PINK1 on the OMM. Besides, ammonia also induced NIX-mediated mitophagy as evidenced by the accumulation of various forms of NIX. The induction of NIX-mediated mitophagy was also mainly dependent on intracellular pH alteration while decreasing ROS levels by NAC or taurine rendered a much weaker accumulation of NIX. Moreover, we discovered that ammonia not only enhanced the initiation of different mitophagy pathways but also increased PGC-1α mediated mitochondrial biogenesis, demonstrating the critical participation of various mQC mechanisms in response to ammonia-induced stress. Regarding biological consequence, we discovered under 5 mM NH4Cl treatment, knockdown of autophagy/mitophagy machinery did not further sensitize astrocytes while at very high levels of ammonia, knockdown of Atg5 led to a significant decrease in cell viability and knockdown of Parkin, PINK1 or NIX led to a less severe decrease, suggesting that autophagy and mitophagy play a pro-survival role under extreme conditions. For possible therapeutic strategies, we found that various ROS decreasing reagents (e.g. NAC and taurine) can lift the autophagy inhibition by ammonia to a large extent, in astrocytes or in animal models of HE. Photoactivatable acidic nanoparticles (paNP) were also proven to be potent in restoring intracellular autophagic activity via lysosome re-acidification in cultured rat astrocytes. This is possibly through improving the activity of lysosome enzymes such as cathepsin L, indicating the potential of novel nanomedicine therapeutics against HE. In conclusion, the work presented here suggests that initiation of Parkin- and NIX-mediated mitophagy as well as insufficient progression of autophagy are involved in the pathogenesis of HE and as such, these are promising targets for the development of future therapies.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Biochemie und Molekularbiologie I
Dokument erstellt am:	14.08.2019
Dateien geändert am:	14.08.2019
Promotionsantrag am:	20.04.2018
Datum der Promotion:	19.06.2018