Dokument: Computational Enzyme Evolution and Design: Studies of Protein Dynamics and Substrate Binding
| Titel: | Computational Enzyme Evolution and Design: Studies of Protein Dynamics and Substrate Binding | |||||||
| Weiterer Titel: | Computergestützte Enzymevolution und -design: Untersuchungen zur Proteindynamik und Substratbindung | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46296 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20180713-092558-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Petrovic, Dusan [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Jun.-Prof. Strodel, Birgit [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Marian, Christel M. [Gutachter] Prof. Dr. Kästner, Johannes [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Enzymes are biomacromolecules able to catalyze chemical reactions. Because of their popularity as catalysts in many industries, enzymology became an advanced field of science. Computational enzymology is an emerging field that provides further insights for the structural and mechanistic characterization of enzymes, and it became a common accessory to the experimental biochemical work. In this thesis, computational enzymology was applied to three different problems.
In the first application, glucose oxidase (GOx) was studied to show how protein dynamics can lead to the formation of both catalytically competent and incompetent enzyme structures. The catalytic histidine residue of GOx is flexible, and molecular dynamics (MD) simulations revealed that this histidine could occupy two possible states of which one is catalytically competent, and the other is not. For quantifying the flexibility of this histidine over an evolutionary trajectory, two types of enhanced sampling MD simulations were performed: Hamiltonian replica exchange (HREX) and umbrella sampling MD. The results of these simulations allowed to explain the catalytic efficiencies of the different GOx mutants. Since MD simulations depend on empirical sets of parameters, called force fields, commonly used force fields were tested for how reliably they represent the different side-chain conformations. For some force fields, including the one used for GOx, a very good agreement with experimental results were obtained, which corroborates the conclusions drawn for GOx. Enzyme selectivity was the focus of the second project. Selectivity, with respect to the chemical reaction that is catalyzed, is an important property of enzymes, in particular for their applications in organic synthesis. Molecular simulations can be used to shift the selectivity of enzymes, as demonstrated here in the case of cytochrome P450 BM3. The shifts of chemo- and regioselectivity of the oxidation of the 14-membered macrocycle beta-cembrenediol were engineered into the V78A/F87A variant of this enzyme, by applying point mutations. The mutations were suggested based on HREX-MD simulations and the enzyme-substrate binding free energies decomposed on a per-residue basis. Substrate binding, which is a major step in the catalytic cycle, was investigated in detail in the third project of this thesis. While many enzymes bind their substrates in buried cavities, some esterases degrading natural polymers (e.g., cellulose, hemicellulose, chitin) developed additional carbohydrate binding modules (CBMs) enabling them to bind to the surface of a substrate. CBMs were shown to be promiscuous, as they can also bind poly(ethylene terephthalate) (PET) and could potentially be fused with PETase enzymes for plastic degradation. MD simulations were able to explain the differences in the PET binding propensities of different CBM peptides. In addition, suggestions were made for mutations to the best-binding CBM for further enhancing their PET affinity. The three projects illustrate how MD simulations can be used for providing a rationale for enzyme evolution and enzyme design purposes. In particular, enhanced sampling simulations such as HREX-MD and umbrella sampling MD provide a thorough understanding of the conformational ensembles of enzymes or enzyme-substrate complexes, and the free energy profiles connecting important enzyme states. Given the computational efficiency and ease of use of HREX-MD, this approach is the method of choice for a comprehensive and fast scanning of the energy landscape of the enzyme dynamics or substrate binding as was demonstrated in this work.===== Enzyme sind Biomakromoleküle, welche in der Lage sind, chemische Reaktionen zu katalysieren. Aufgrund ihrer Beliebtheit als Katalysatoren in vielen Industriezweigen wurde die Enzymologie zu einem wichtigen Feld der Wissenschaft. Die computergestützte Enzymologie ist ein aufstrebender Fachbereich, der weitreichende Erkenntnisse für die strukturelle und mechanistische Charakterisierung von Enzymen liefert und zusehends Einsatz im Bereich des Enzymdesigns findet. In dieser Arbeit wurde die computergestützte Enzymologie auf drei verschiedene Fragestellungen angewendet. In der ersten Fragestellung wurde Glucoseoxidase (GOx) mit dem Ziel untersucht zu erklären, wie die Proteindynamik zur Bildung von katalytisch kompetenten als auch inkompetenten Enzymstrukturen führen kann. Molekulardynamik-(MD-)Simulationen haben offengelegt, dass der katalytische Histidinrest von GOx flexibel ist und zwei mögliche Zustände annehmen kann, von denen einer für die Katalyse geeignet ist und der andere nicht. Zur Quantifizierung der Flexibilität dieses Histidinrests über eine evolutionäre GOx-Trajektorie wurden zwei Arten von erweitertem Sampling durchgeführt: Hamiltonian Replica Exchange-(HREX-) und Umbrella Sampling-MD-Simulationen. Die Ergebnisse dieser Simulationen erlaubten es, die katalytische Effizienz der verschiedenen GOx-Mutanten zu erklären. Da MD-Simulationen von empirischen Parametern, sogenannten Kraftfeldern, abhängen, wurden die gebräuchlichsten Kraftfelder im Hinblick ihrer Fähigkeit getestet, wie zuverlässig sie Seitenkettenpopulationen repräsentieren können. Für einige Kraftfelder, einschließlich des für GOx verwendeten Kraftfeldes, wurde eine sehr gute Übereinstimmung mit experimentellen Daten erzielt. Dieses Ergebnis untermauert die für GOx gezogenen Schlussfolgerungen hinsichtlich der Seitenkettendynamik des Histidinrests im aktiven Zentrum. Die Enzymselektivität stand im Mittelpunkt des zweiten Projektes. Die Selektivität in Bezug auf die chemische Reaktion, welche sie katalysieren, ist eine wichtige Eigenschaft von Enzymen, insbesondere für deren Anwendung in der organischen Synthese. Mittels MD-Simulationen ist es möglich, die Selektivität von Enzymen zu modifizieren, wie in dieser Arbeit im Falle von Cytochrom P450 BM3 gezeigt wurde. Die Veränderung der Chemo- und Regionselektivät der Oxidation des 14-gliedrigen Makrozyklus beta-Cembrenediol wurde durch Punktmutationen der Enzymvariante V78A/F87A realisiert. Die Mutationen wurden auf der Grundlage von HREX-MD-Simulationen und der Enzym-Substrat-Bindungsenergien, welche in ihre Anteile je Aminosäure zerlegt wurden, vorgeschlagen. Die Substratbindung, welche einen wichtigen Schritt im Katalysezyklus darstellt, wurde im dritten Projekt dieser Arbeit untersucht. Während viele Enzyme ihre Substrate in Vertiefungen im Innern des Proteins binden, entwickelten einige Esterasen, die natürliche Polymere abbauen (z.B. Cellulose, Hemicellulose, Chitin), zusätzliche Kohlenhydrat-Bindungsmodule (CBMs), die es ihnen ermöglichen an die Oberfläche des Substrates zu binden. Einige dieser CBM-Peptide können auch Poly(ethylenterephthalat) (PET) binden, was die attraktiveMöglichkeit eröffnet, diese CBMs mit PETase-Enzymen für den Abbau von Plastik zu kombinieren. Mithilfe von MD-Simulationen konnten die unterschiedlichen PET-Bindungseigenschaften verschiedener CBM-Peptide erklärt werden. Darüber hinaus wurden Vorschläge für Mutationen unterbreitet, umdie Affinität für PET des am besten bindenden CBM-Peptids weiter zu verbessern. Diese drei Projekte veranschaulichen, wie MD-Simulationen es ermöglichen, Prinzipien der Enzymevolution aufzudecken und wertvolle Beiträge für das Design von Enzymen zu liefern. Insbesondere Simulationenmit verbessertem Sampling wie beispielsweise HREX-MD und Umbrella Sampling-MD tragen zu einem besseren Verständnis der Konformationsenesmble von Enzym-Substrat-Komplexen bei und erlauben die Bestimmung von Energieprofilen zwischen wichtigen Zuständen während der Katalyse. Angesichts der rechnerischen Effizienz und der Benutzerfreundlichkeit von HREX-MD ist dieser Ansatz eine vielversprechende Methode in der computergestützten Enzymologie, wie in dieser Arbeit gezeigt wurde. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Theoretische Chemie und Computerchemie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 13.07.2018 | |||||||
| Dateien geändert am: | 13.07.2018 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 19.10.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 14.02.2018 |
