Dokument: Etablierung dreidimensionaler Zellkulturmodelle zur Untersuchung des Differenzierungs‐ und Kalzifizierungsverhaltens valvulärer Interstitialzellen unter Zytokinstimulation
| Titel: | Etablierung dreidimensionaler Zellkulturmodelle zur Untersuchung des Differenzierungs‐ und Kalzifizierungsverhaltens valvulärer Interstitialzellen unter Zytokinstimulation | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46293 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20180621-113501-3 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Hof, Alexander [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. Lichtenberg, Artur [Gutachter] PD Dr. med. Simon, Florian [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Hintergrund: Die Aortenklappendegeneration wird zunehmend als komplexer Pathomechanismus verstanden, in welchen sowohl Matrixbestandteile als auch Signalmoleküle und Zellen der Herzklappe eingebunden sind. Darüberhinaus können die Zellen des Klappeninterstitiums Einfluss auf die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix (ECM) nehmen und sind so an valvulären Wachstums- und Regenerationsprozessen beteiligt. Da sowohl mechanische als auch biologische Klappenprothesen avital sind, weisen sie diese Eigenschaften nicht auf, wodurch die Haltbarkeit biologischer Klappenprothesen stark eingeschränkt wird und ein Wachstum der Klappenprothese unmöglich ist. Diesem Umstand ist es geschuldet, dass Re-Operationen an der Herzklappe unter erhöhtem Risiko durchgeführt werden müssen.
Ziele der Arbeit: Im Rahmen der vorliegenden Studie sollen dreidimensionale (3D), ECM-basierte Zellkulturmodelle zur Anzucht primärer, oviner valvulärer Interstitiallen (VIC) etabliert werden. Ausgehend von diesen Modellen soll zum einen das phänotypische Verhalten der VIC unter Zytokinstimulation sowie verschiedene target-Proteine, welche im Rahmen der Aortenklappendegeneration eine Rolle spielen untersucht werden. Zudem könnten interstitiell rebesiedelte, tissue engineerte Herzklappen die Grundlage für die Entwicklung verbesserter Herzklappenprothesen darstellen, weshalb es Möglichkeiten der interstitiellen Rebesiedlung dezellularisierter Klappensegel zu eruieren gilt. Methodik: Es wurden zwei Arten von 3D-Kulturmodellen entwickelt. VIC wurden in matrigelbasierten Kulturen (mECM) unter Zytokinstimulation herangezüchtet, wobei der Einfluss von prokalzifizierenden Substanzen, transforming growth factor β (TGFβ) und vascular endothelial growth factor (VEGF) untersucht wurde. Hierzu wurden die makroskopische Kulturgröße, die histologische Morphologie sowie Indikatoren der Matrixkalzifizierung untersucht. Zudem wurde die Expression von Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP) als Apoptosemarker, α-smooth muscle actin (αSMA), Osteopontin (OPN), cluster of differentiation 73 (CD73) und Matrix-Metalloproteasen (MMPs) analysiert. Die Aktivität der tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP) und der MMP2 und 9 wurden ebenfalls beurteilt. Weiterhin wurden Ansätze zur Kultivierung von VIC in dezellularisierten, ovinen Aortenklappensegeln (dECM) erprobt. Dabei wurde der Einfluss einer Photomanipulation der dECM-Oberfläche mittels Femto second Laser (FsL), einer enzymatischen Behandlung der dECM mit Trypsin sowie der Variation von Zellzahl und Nährstoffangebot auf die Qualität der interstitiellen Rebesiedlung analysiert. Ergebnisse und Diskussion: TGFβ bewirkte in den mECM-Kulturen eine starke Matrixkompaktion im Verlauf der Kultivierung sowie eine Apoptoseinduktion, welche sich signifikant von den anderen Konditionen unterschied. Unter VEGF-Stimulation hingegen konnte eine deutliche Reduktion der αSMA-Expression gegenüber TGFβ gezeigt werden. Signifikante Effekte auf die Expression von MMPs, CD73 oder OPN konnten allerdings nicht nachgewiesen werden. Ebensowenig konnte eine manifeste Kalzifizierung der Matrix gesehen werden. Möglicher Grund könnte das Fehlen zusätzlicher, mechanischer Reize, die Matrixbeschaffenheit und eine zu kurze Kultivierungsdauer sein. Im Falle der dECM-Modelle zeigten sich die qualitativ und quantitativ besten Rebesiedlungsergebnisse bei enzymbehandelten dECM, hoher ausgesäter Zellzahl und verbessertem Angebot an Nährstoffen. Photomanipulierte dECM wiesen teils perifokale, oberflächliche Matrixbesiedlungen um die Disruptionsstellen auf. Demgegenüber war bei unbehandelten dECM keine Matrixbesiedlung mit VIC zu beobachten. So ist eine Barrierefunktion der Basalmembran für die Migration von VIC naheliegend, welche durch enzymatische Behandlung oder Photomanipulation mittels FsL überwunden werden kann. Schlussfolgerung: VEGF und TGFβ nehmen Einfluss auf das Expressionsmuster von VIC, jedoch zeigen sich Zytokineffekte im etablierten 3D-Modell verglichen mit Ergebnissen aus 2D-Zellkulturen abgeschwächt. Eine intakte Basalmembran ist mit der interstitiellen Besiedlung von dECM nicht vereinbar. Durch additive Manipulation der dECM-Oberfläche sowie Modifikationen des Besiedlungsprotokolls lässt sich die Qualität der interstitiellen Rebesiedlung optimieren.Background: The development of aortic valve degeneration is becoming increasingly understood as a complex pathomechanism, in which peptides of the extracellular matrix (ECM) as well as signal molecules and valvular interstitial cells (VIC) are involved. VIC can influence the composition of valvular ECM and by this control growth and regeneration processes of the native aortic valve. Both, mechanical and biological aortic valve prostheses consist of avital tissue and do therefore not have these properties. This makes valvular growth impossible and contributes to a relatively short durability of biological valve prostheses so that re-operations with an increased risk of complications or – in case of mechanical valve prostheses - a lifelong anticoagulation might be needed. Objective: Aim of the present study was to establish ECM-based 3D cell culture models for primary ovine VIC. Subsequently, the effect of cytokines on VIC phenotype as well as different target-proteins playing a substantial role in aortic valve degeneration should be analysed. Furthermore, various approaches for interstitial repopulation of decellularized aortic valve leaflets with VIC should be evaluated. Interstitially repopulated, tissue-engineered heart valves might provide new perspectives in the development of improved heart valve prostheses with the potential of growth and regeneration. Methods: Two types of 3D cell culture models were established. VIC were cultured in matrigel-based ECM (mECM) and stimulated with procalcifying agents, TGFβ or VEGF. Culture shrinking was measured macroscopically indicating the extent of matrix compaction. 3D culture morphology and cell distribution were examined by histological analysis and indicators of matrix calcification and apoptosis were scrutinized. In addition, expression of α smooth muscle actin (αSMA), osteopontin (OPN), cluster of differentiation 73 (CD73) und matrix metalloproteases (MMP) were analyzed as well as the activity of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNAP) and MMP2 and MMP9 in stimulated mECM cultures. Different approaches for VIC cultivation in decellularized, ovine aortic valve leaflets (dECM) were applied evaluating the influence of dECM surface manipulation by Femto second Laser (FsL), enzymatic digestion with trypsin or variation of nutrient supply and number of cells seeded on quality of interstitial dECM repopulation. Results and discussion: TGFβ-treated mECM cultures showed a significantly increased degree of matrix compaction and a higher rate of apoptosis compared to other conditions. In VEGF-treated mECM cultures, αSMA-expression was reduced in comparison to TGFβ-treatment. There were neither significant effects on MMP-, CD73- or OPN-expression, nor proper matrix calcification of mECM cultures. A possible explanation for this could be the absence of additional mechanical stimuli or the mechanical properties of mECM cultures themselves, which have been shown to have synergistic effects on VIC transdifferentiation combined with TGFβ. Furthermore, cultivation time could have an impact on calcification and transdifferentiation of mECM cultures. For dECM cultures, best reseeding results were seen in trypsin-treated dECM with a high number of seeded cells and improved nutrient supply. Photomanipulation of dECM has been shown for the first time to faciliate interstitial dECM repopulation with VIC, however matrix repopulation was limited to perifocal and superficial areas around the disruption sides. In untreated dECM, interstitial repopulation could not be observed. These findings suggest a barrier function of the basement membrane inhibiting VIC migration into the valvular matrix, which can be overcome by trypsinisation or photomanipulation with FsL. Conclusion: VEGF as well as TGFβ affect the expression pattern of VIC, but cytokine effects were revealed to be mitigated in the established mECM culture model compared to 2D VIC cultures. Interstitial repopulation of dECM is not compatible with an intact basement membrane. By additional manipulation of the matrix surface and modifications of the reseeding protocol, quality of interstitial dECM repopulation can be optimized. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 21.06.2018 | |||||||
| Dateien geändert am: | 21.06.2018 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 16.01.2018 | |||||||
| Datum der Promotion: | 05.06.2018 |
