Dokument: Die Bedeutung des PKA-mKCa-Kanal-Signalweges beim alterungsbedingten Wirkverlust kardioprotektiver Interventionen -Studie am Rattenherzen in vivo und proteinbiochemische Analysen-
| Titel: | Die Bedeutung des PKA-mKCa-Kanal-Signalweges beim alterungsbedingten Wirkverlust kardioprotektiver Interventionen -Studie am Rattenherzen in vivo und proteinbiochemische Analysen- | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46283 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20180628-092142-1 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Ströthoff, Martin [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Bauer, Inge [Gutachter] Prof. Dr. Dr. rer. nat. Cortese-Krott, Miriam [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Eine pharmakologische Präkonditionierung mit Forskolin, die über eine Steigerung der Adenylatcyclaseaktivität eine Proteinkinase-A (PKA) Aktivierung initiiert, führt bei alten Ratten im Gegensatz zu jungen Tieren zu keiner Kardioprotektion. Demgegenüber führt eine Aktivierung mitochondrialer kalziumabhängiger Kaliumkanäle (mKCa) mit NS1619 in jungen wie in alten Versuchstieren zu einer Infarktgrößenreduktion. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel dieser Arbeit, den funktionellen Zusammenhang des Signalweges „PKA-mKCa-Kanal“ genauer aufzuklären und die Frage zu beantworten, ob die Ursache im alterungsbedingten Wirkverlust kardioprotektiver Maßnahmen innerhalb jenes Signalweges zu finden ist.
Die Versuche wurden an einem in vivo Myokardinfarktmodell durchgeführt, bei welchem Wistar-Ratten einer 25-minütigen regionalen Myokardischämie mit einer 120-minütigen Reperfusion unterzogen wurden. In einer Dosisfindungsserie wurden die niedrigsten kardioprotektiven Dosen von Forskolin und NS1619 bestimmt. Ein möglicher funktioneller Zusammenhang von PKA und mKCa-Kanal wurde in einer weiteren Versuchsserie ermittelt, bei welcher der Effekt einer pharmakologischen Inhibition des mKCa-Kanals mit Iberiotoxin auf die Forskolin-induzierte Kardioprotektion untersucht wurde. Des Weiteren wurde eine mögliche Altersabhängigkeit einer Kardioprotektion von Forskolin und NS1619 sowie eine Altersabhängigkeit des Effekts von Forskolin auf die PKA-Aktivität untersucht (22-24 Monate alte Wistar-Ratten). Hierzu wurden cAMP-Spiegel mittels ELISA sowie der Phosphorylierungsgrad von Phospholamban als Marker der PKA-Aktivität nach Forskolinapplikation mittels Western-Blot im Myokardgewebe bestimmt. Durch Präkonditionierung mit NS1619 (10 μg/kg/min; NS10) und Forskolin (30 μg/kg, For30) wurde bei den jungen Tieren eine signifikante Infarktgrößenreduktion erreicht (Kon: 64±7 %, NS10: 41±11 %, For30: 34± 6 %, p<0,05, dargestellt als Mittelwert±Standardabweichung). Eine gleichzeitige Gabe von Iberiotoxin (6 μg/kg/min; Ibtx) hob die Forskolin-induzierte Präkonditionierung vollständig auf (For30+Ibtx: 63±12 % vs Kon: 67±8 %, p>0,05). Bei den alten Tieren führte eine Präkonditionierung mit NS1619 (10 μg/kg/min und 30 μg/kg/min) ebenfalls zu einer effektiven Infarktreduktion (Kon: 56±6 %, NS10: 35±8 %, NS30: 37±7 %, p<0,05). Forskolin (30 μg/kg und 100 μg/kg) konnte jedoch keine Kardioprotektion im alten Myokard auslösen, auch nicht mit höherer Dosierung (For30: 51±10 %, For100: 50±11 % vs Kon). Die cAMP-Spiegel waren bei jungen wie alten Tieren ähnlich (jung: 4,3±0,4 pmol/mg Protein, alt: 3,4±0,5 pmol/mg Protein) und stiegen nach Forskolinstimulation gleichermaßen an (For30 jung: 5,3±0,8 pmol/mg, For30 alt: 5,1±1,2 pmol/mg vs Kon, p<0,05). Phosphoryliertes Phospholamban, als Maß für die PKA-Aktivität war basal (jung: 1,1±0,4, alt: 0,9±0,5) und durch Forskolin gesteigert in jungen und alten Tieren auf vergleichbarem Niveau (For30 jung: 2,4±0,7, For30 alt: 2,4±1,3 vs Kon, p<0,05). Die Ergebnisse zeigen, dass eine direkte mKCa-Kanalaktivierung eine Kardioprotektion in jungen wie alten Tieren auslösen kann. Demgegenüber reduziert eine Aktivierung der PKA, welche dem mKCa-Kanal innerhalb der Signaltransduktion vorangeschaltet zu sein scheint, lediglich bei den jungen Tieren die Infarktgröße. Die molekularbiologischen Analysen deuten jedoch daraufhin, dass kein altersabhängiger Unterschied in der Funktion und Regulation der PKA herrscht. Dieser im Alter zunehmende Wirkverlust scheint zwar innerhalb des Signalweges zu liegen, jedoch muss dieser proximal des mKCa-Kanals und distal der PKA lokalisiert sein. Aufgrund einer bestehenden Interaktion von Connexin43 und der PKA und einer vermuteten Verbindung zu mitochondrialen Kaliumkanälen und deren Einfluss auf den Kaliumeinstrom, könnte Connexin43 einen vielversprechenden Signalschritt darstellen. Zudem gibt es Hinweise auf eine altersabhängige Abnahme des mitochondrialen Connexin43-Gehaltes und einen Einfluss von Cx43 auf Mechanismen der Präkonditionierung. Daher wurde die vorliegende Untersuchung dahingehend ergänzt und es konnte eine Abnahme der mitochondrialen Cx43-Proteinexpression im Herz von alten Versuchstieren nachgewiesen werden. Die funktionelle Bedeutung ist Gegenstand aktueller Untersuchungen.In contrast to young hearts, a phamacological preconditioning with the protein kinase A (PKA) activator forskolin is lost in the aged heart. However, activation of mitochondrial Ca2+-sensitive potassium (mKca) channels with NS1619 initiated cardioprotection also in the aged heart and these channels act as a possible PKA downstream target. Thus, the aim of this study was to investigate the functional connection of PKA and mKCa channels and whether the age-dependent loss of cardioprotection is caused by differences in PKA regulation and signalling pathways of PKA and mKCa channels. We used an in vivo rat model with regional myocardial ischemia and treated young (2-4 months) and aged (22-24 months) Wistar rats with PKA activator forskolin, KCa channel activator NS1619 and/or KCa channel blocker iberiotoxin for 10 min before ischemia. All animals underwent 25 minutes regional ischemia followed by 120 minutes reperfusion. At the end of the protocol the hearts were excised for infarct size measurement using TTC-staining. First we performed a dose-response study of NS1619 and forskolin in young animals to determine the lowest protective dose. Next, to investigate whether the mKCa channel is critically involved in forskolin- and PKA-induced cardioprotection and a downstream target of PKA, young animals received the lowest protective dose of forskolin in the presence or absence of the KCa channel blocker iberiotoxin. Based on the result obtained in the dose-response study in young animals we tested the age-dependent effects of forskolin and NS1619 in the aged heart and measured the infarct size. To assess the activation of PKA by forskolin in young and aged hearts, we determined the myocardial cAMP levels by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and analysed the expression of myocardial phosporylated phospholamban as a marker of PKA activity after stimulation with forskolin. NS1619 (10 μg/kg/min; NS10) and forskolin (30 μg/kg, For30) initiated cardioprotection in young rat hearts (infarct size: NS10: 41±11 %, For30: 34± 6 %, p<0,05 vs. Kon: 64±7%). In the presence of iberiotoxin (6 μg/kg/min; Ibtx) the forskolin-induced effect was completely abrogated (For30+Ibtx: 63±12 % vs Kon: 67±8%, p>0,05). In the aged rat heart NS1619 (10μg/kg/min and 30μg/kg/min) reduced infarct size similar to young hearts (Kon: 56±6%, NS10: 35±8%, NS30: 37±7%, p<0,05). Although forskolin (30μg/kg and 100 μg/kg) had no effect on infarct size in aged hearts (For30: 51±10%, For100: 50±11% vs Kon), forskolin (30μg/kg) increased both cAMP levels and PKA activity in aged hearts to the same extent as in young hearts. These data show that a direct activation of mKCa channels by NS1619 initiates a cardioprotection in young and aged rat hearts. In contrast to young hearts, a PKA activation upstream of mKCa by forskolin shows no infarct size reduction in aged hearts. However the results of cAMP levels and PKA activity suggest that age-related differences in PKA activity and regulation are not the underlying reason for the age-related loss of forskolin-induced cardioprotection. The underlying mechanism appears to be within this signaling pathway, most likely localized between PKA and mKCa channels, so that mKCa channels are not directly regulated by PKA. This possible step could be Connexin 43 (Cx43), because Cx43 is linked with PKA and mKCa. Furthermore, evidence exists that Cx43 is involved in preconditioning mechanisms and the myocardial content of Cx43 decreases with increasing age. We measured a reduced Cx43 expression level in the mitochondrial fraction in cardiac tissue of aged rats, suggesting that this could provide a mechanism of age-related loss of cardioprotection. | |||||||
| Quelle: | Heinen A., Ströthoff M., Schmidt A., Stracke N., Behmenburg F., Bauer I., Hollmann M.W., Huhn R., (2014), Pharmacological options to protect the aged heart from ischemia and reperfusion injury by targeting the PKA-BKCa signaling pathway. Experimental Gerontology (56) 99–105 | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 28.06.2018 | |||||||
| Dateien geändert am: | 28.06.2018 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 06.09.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 14.06.2018 |
