Dokument: Natural and Modified Active Sites in [FeFe] Hydrogenases in the Crosshairs of Biophysical Methods

Titel:	Natural and Modified Active Sites in [FeFe] Hydrogenases in the Crosshairs of Biophysical Methods
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=46216
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180613-112433-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Sommer, Constanze [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 16,74 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 11.06.2018 / geändert 11.06.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Lubitz, Wolfgang [Gutachter] Prof. Dr. Heise, Henrike [Gutachter]
Stichwörter:	[FeFe] Hydrogenase, Magnetic resonance, FT IR
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	In dieser Arbeit werden [FeFe] Hydrogenasen spektroskopisch und elektrochemisch untersucht, wodurch ein besseres Verständnis des Katalysezykluses und Einblicke in die elektronische Struktur des H-Clusters gewonnen werden. Die Probenherstellung, einschließlich der Überexpression in E. coli und der künstlichen Reifung der [FeFe] Hydrogenasen mit dem natürlichen oder modifizierten Vorläuferkomplexen werden diskutiert. Die Redoxzustände des H-Clusters im Katalysezyklus werden mit einer pH-abhängigen FTIR-Spektroelektrochemie analysiert, wobei bei der schrittweisen Reduktion des H-Clusters eine protonengekoppelte elektronische Umlagerung beobachtet wird. Durch diese Umlagerung wird vermutlich eine erhöhte Übergangsenergie im Zyklus vermieden. Die [FeFe] Hydrogenase HydA1 wird erstmals mittels paramagnetischer 1H NMR Spektroskopie untersucht. Diese Technik ermöglicht Messungen bei physiologischen Temperaturen und die direkte Detektion von Protonen. Trotz einer Größe von 48 kDa können hochaufgelöste NMR-Spektren von HydA1 in drei Zuständen (Hox, Hox-CO, Hhyd) gemessen werden, die Einblicke in die elektronische Struktur ermöglichen. Desweiteren wird der Schwefel gegen Selen Austausch (S-zu-Se) im aktiven Zentrum mit einem Aza-propan- oder einem Propan-Brückenliganden untersucht. Hydrogenasen mit Azapropan-diselenat-Brückenligand zeigen volle katalytische Aktivität; dies ist die erste Modifikation ohne Aktivitätsverlust, allerdings bildet sich schnell der CO inhibierte Zustand unter Laborbedingungen. Eine detaillierte Analyse des S-zu-Se Austauschs ist mit Propandiselenat-Brücke möglich. Selen beeinflusst die Ligandenvibrationen, verändert die elektronische Struktur und reduziert die Spindichte am verbrückenden Liganden im aktiven Zentrum. Abschließend wird der Prozess der künstlichen Reifung auf Nicht-Eisen Hydrogenasen erweitert. [RuRu] Hydrogenasen stabilisieren das terminale Hydrid-Intermediat. In this work spectroscopic and electrochemical investigations on [FeFe] hydrogenases are presented leading to an improved understanding of the catalytic cycle and giving insight into the electronic structure of the H-cluster, a complex 6Fe6S cluster in the active site of the enzyme. Overexpression in E. coli and artificial maturation of [FeFe] hydrogenases with the natural or modified precursor complexes are discussed in detail. The redox states of the H-cluster in the catalytic cycle are analyzed with pH dependent FTIRspectroelectrochemistry revealing a proton coupled electronic rearrangement during the stepwise reduction of the H-cluster. This rearrangement is presumed to ensure a smooth energy surface over the catalysis pathway. The [FeFe] hydrogenase HydA1 is studied for the first time using paramagnetic 1H NMR spectroscopy. This technique allows measuring at physiological temperatures and direct detection of protons. Despite the large size of HydA1 (48 kDa) high resolution NMR spectra can be obtained. The [4Fe-4S]H [2Fe]H active site, is studied in the three states (Hox, Hox-CO, Hhyd). The chemical shifts and temperature CH2 proton signals are interpreted based on an exchange coupling model and known magnetic coupling constants. Furthermore, sulfur to selenium (S-to-Se) exchange in the active site was studied with an aza-propane- or a propane-bridging ligand. Hydrogenases maturated with the aza-propane-diselenate bridging ligand show full activity. This is the first modification without any activity loss but with reduced stability under laboratory conditions. HydA1 with a propane-diselenate bridge is more stable and allows detailed spectroscopic analysis of the S-to-Se exchange. Selenium affects the ligand vibrations, changes the electronic structure and reduces the spin density on the bridging ligand in the active site. Finally, the artificial maturation process has been expanded to the first non-iron hydrogenase with a [2Ru]H site that stabilizes the key terminal hydride intermediate.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	13.06.2018
Dateien geändert am:	13.06.2018
Promotionsantrag am:	20.02.2018
Datum der Promotion:	03.05.2018