Dokument: Analyse der Immunantwort gegen intrazelluläre Pathogene in der mGBP2-defizienten Mauslinie

Titel:	Analyse der Immunantwort gegen intrazelluläre Pathogene in der mGBP2-defizienten Mauslinie
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URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180611-101741-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Mehlhorn, Tim [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,98 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 08.06.2018 / geändert 08.06.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Pfeffer, Klaus [Gutachter] Prof. Dr. Feldbrügge, Michael [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Der zur Gruppe der Apicomplexa gehörende, obligat intrazelluläre Parasit Toxoplasma gondii ist der Erreger der Toxoplasmose. Zu den Symptomen, meist in immunsupprimierten Patienten auftretend, gehören schwere Organschäden, sowie eine Enzephalitis. Ebenso kann bei Erstinfektion von Schwangeren der Fötus durch plazentale Transmission geschädigt werden. Der Erreger ist weltweit verbreitet, wobei ein Drittel der Weltbevölkerung latent infiziert ist (WHO). In der vorgelegten Arbeit wurde die Funktion des in Vertebraten konservierten Guanylat- bindenden Proteine (GBP) 2 der p65- Familie, mit besonderer Fokussierung auf die Toxoplasma gondii Infektion, untersucht. Die murinen GBPs (mGBPs) werden durch Typ I und II Interferone induziert. Die Steuerung findet über den JAK-STAT- Signalweg statt. Dieser Arbeit vorangehende in vitro Versuche in murinen embryonalen Fibroblasten (MEF) zeigten eine weniger effektive Bekämpfung von intrazellulären T. gondii in mGBP2- defizienten Zellen. Des Weiteren wurde die Rekrutierung zur parasitophoren Vakuole (PV), sowie die Kolokalisation von mGBP2 mit der PV Membran (PVM) mittels Konfokalmikroskopie gezeigt. Die generierte GBP2-/- Mauslinie zeigte schließlich erhöhte Mortalitätsraten bei intraperitonealer Infektion mit 20 bzw. 40 Zysten T.gondii ME49. Ziel dieser Dissertation war es, die Immunantwort der mGBP2-/- Mauslinie auf zellulärer und molekularer Ebene nach einer Infektion mit obligat intrazellulären Erregern näher zu untersuchen. Die T- Zell Immunantwort ist eine der wichtigsten immunologischen Reaktionen auf ein Pathogen und wird über die Haupthistokompatibilitäts – Komplexe (MHC) Typ I, und Typ II gesteuert. In Vorarbeiten wurde eine geringere intrazelluläre Zerstörung der T. gondii PV in mGBP2-/- MEFs beobachte, was im in vivo Modell in einer geringeren Antigenpräsentation über den MHC I und II Präsentationsweg und damit einhergehender verringerter Anzahl Toxoplasma- spezifischer CD8+ bzw. CD4+ T- Zellen resultieren könnte. Um die T. gondii spezifische CD8+ T- Zell Antwort zu analysieren, wurden Mäuse vom WT und der mGBP2-/- Mauslinie mit 20 Zysten i.p. infiziert und den Tagen 7, 14, 21 und 28 p.i. die T- Zellen der Milzen durch Durchflusszytometrie mit Hilfe eines MHC-I-Pentamers, der ein T. gondii spezifisches Epitop (SVLAFRRL) trug, analysiert. Es zeigte sich eine potente T.gondii spezifische CD8+ T Zell Frequenz in der mGBP2-/- Mauslinie und kein signifikanter Unterschied zu den Kontrolltieren. Durch intrazelluläre Zytokinfärbung (ICS) wurde gezeigt, dass eine potente, mit der mGBP2+/+ Maus vergleichbare CD4+ T- Zell Antwort in der mGBP2-/- Mauslinie stattfindet. So wurde gezeigt, dass die Präsentation der Antigene über den MHC I und II Signalweg, sowie die daraus folgende T- Zell Antwort durch ein Fehlen von mGBP2 nicht beeinträchtigt wird. Ein weiteres Projekt der Doktorarbeit war die Analyse und der Vergleich der Stadienkonver-sion von T. gondii in mGBP2+/+ und mGBP2-/- Mäusen durch Etablierung einer Taq-Man qRT-PCR. Der Erreger wird von der Maus meist in Form von Oozysten aufgenommen, aus welchen sich innerhalb weniger Tage das sich schnell teilende Stadium, die Tachyzoiten, bildet. Die Infektion findet innerhalb der ersten 14 Tage hauptsächlich in Lunge, Leber und Milz statt. Anschließend findet beim immunkompetenten Wirt eine Verlagerung der Infektion ins Gehirn statt und eine mehr oder minder zeitgleiche Konversion der Tachyzoiten zu sich langsam teilenden Bradyzoiten. Diese sind in der Lage im Gehirn Zysten zu bilden. Es wurde beschrieben, dass es in vitro möglich ist durch die Verwendung stadienspezifischer Gene in einer qRT-PCR Tachyzoiten von Bradyzoiten zu unterscheiden. Die Expression solcher stadienspezifischen Gene sollte in mGBP2-/- Mäusen ermittelt werden, um zu untersuchen, ob sie in der Lage sind die Infektion mit T.gondii zu bekämpfen und die Stadienkonversion eingeleitet wird. Im in vivo Infektionsmodell zeigte sich, dass in der mGBP2-/- Maus die Stadienkonversion in einem mit der mGBP2+/+ Mauslinie vergleichbaren Maße stattfindet. Um einen weiteren Einblick in die Immunantwort der mGBP2-/- Maus zu erlangen, wurde die Expression zahlreicher Zytokine auf RNA- Ebene mittels qRT-PCR, sowie auf Protein- Ebene mittels ELISA, untersucht. Viele analysierten Zytokine, wie IFNγ, IL- 1β, IL- 4, IL- 6 zeigten keine signifikanten Unterschiede, bei Infektion der Tiere mit 20 oder 40 Zysten i.p. Bei der Analyse von IFN-α und IFN-β bei der 40 Zysten Infektion konnte eine signifikante Hochregulation der Genexpression in der Lunge der mGBP2-/- Mauslinien gezeigt werden. Die Expression von TLR11 und TLR12 war dagegen in der mGBP2-/- Mauslinie signifikant verringert. Diese veränderten Expressionsmuster von immunrelevanten Genen könnten zur beobachteten hohen Mortalitätsrate der mGBP2-/- geführt haben. Um die Funktion von mGBP2 bei anderen intrazellulären Pathogenen zu analysieren, wurden weitere Infektionsversuche mit dem lymphozytischen Choriomeningitis Virus (LCMV) und dem vesikulären Stomatitis Virus (VSV) durchgeführt. Hier wurden die Erreger- spezifischen CD4+ und CD8+ T- Zell Antworten, der Virustiter und andere immunologische Parameter bestimmt, wobei sich keine signifikanten Unterschiede zeigten. The apicomplexan parasite Toxoplasma gondii is the causative agent of Toxoplasmosis. The symptoms, mostly occurring in immunocompromised patients, reach from heavy organ damage to a severe encephalitis. The pathogen is distributed worldwide whereas one third of the human world population is latently infected. In this dissertation the function of the guanylate-binding protein (GBP) 2 of the p65- family, which is conserved in vertebrates, has been studied, focussing on the infection with T. gondii. The murine GBPs (mGBPs) are induced via type I and type II Interferons and regulated via the JAK-STAT- signalling pathway. Prior to this work it was found that in vitro murine embryonic fibroblasts (MEFs) show less effective clearance of intracellular T. gondii when lacking mGBP2. Furthermore, the recruitment to and the colocalization of mGBP2 at the parasitophorous membrane (PV) was shown applying confocal microscopy. The then generated mGBP2- deficient mouse strain finally showed a higher mortality rate when infected with 20 and 40 cysts intraperitoneally (i.p.). The aim of this dissertation was to analyze the immune response of the mGBP2-/- mouse strain extensively on the cellular and molecular level after infection with obligatory intracellular pathogens. The T- cell response is one of the most important immunological reactions towards a pathogen and is controlled via the presentation pathways of the major histocompatibility complex (MHC) I and II. Since there has been found a lower clearance of intracellular T. gondii in mGBP2-/- MEFs it was thought that there might be a reduced presentation of antigen via MHC I and II, hypothetically leading to a reduced number of T. gondii specific CD4+ and CD8+ T- cells. To address the question whether the CD8+ T- cell response is reduced mGBP2+/+ and mGBP-/- mice where infected with 20 cysts i.p. On day 7, 14, 21 and 28 post infection (p.i.) the mice were sacrificed and the T- cells of their spleens were analyzed with flow cytometry using a MHC-I Pentamer with a T. gondii specific epitope (SVLAFRRL). It was shown that there was a potent CD8+ T- cell response in the mGBP2-/- mouse strain and it did not differ significantly from the CD8+ T- cell response of the mGBP2+/+ mouse strain. Further experiments using intracellular cytokine staining (ICS) showed a potent CD4+ T- cell response in mGBP2-/- mice. Therefore, it was shown, that the antigen presentation via MHC I and MHC II is not impaired in the mGBP2- deficient mouse strain. Another project of the thesis was the analysis and comparison of the stage conversion of T. gondii ME49 in mGBP2+/+ and mGBP2-/- mice by establishing a Taq-Man qRT-PCR. The pathogen is naturally taken up by mice as oocysts, out of which in only a few days the fast dividing stages of the Tachyzoites emerge. The acute infection, for which tachyzoites are specific, lasts approximately 14 days mainly in the lungs, liver and spleen of the animals. After this time the infection relocates in immunosufficient animals towards the brain and a stage conversion to the slowly dividing, cyst- building bradyzoites occurs. It has been published that it is possible, by using stage- specific genes, to distinguish between tachyzoites and bradyzoites by qRT-PCR in vitro. After establishing a qRT-PCR on stage- specific genes in vitro the stage- conversion was measured in vivo. Therefore mGBP2+/+ and mGBP2-/- mice were infected with 20 cysts i.p. and sacrificed on day 7, 14, 21, 28 p.i. It showed that in the mGBP2-/- there is a potent induction of the stage- conversion, comparable to the mGBP2+/+ mouse strain. To further address the immune response of the mGBP2- deficient mouse strain on the molecular level, the expression of a multitude of cytokines and effector molecules were analyzed on the RNA level. Many analyzed cytokines like IFNγ, IL- 1β, IL- 4, IL- 6 did not show a significant difference when mice where infected with 20 or 40 cysts i.p. The analysis of IFN-α and IFN-β in the 40 cysts infection model did show a significant upregulation of this cytokine in the lungs of mGBP2-/- animals on day 7 p.i. The expression of TLR 11 and TLR 12 on the other hand was significantly reduced by this time in the mGBP2- deficient mice. The differences in these expression pattern might lead to or contribute to the high mortality rate of the mGBP2-/- mouse strain when infected with T. gondii ME49. To address the function and role of mGBP2 towards other obligatory intracellular pathogens further infection experiments were performed using the lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) and the vesicular stomatitis virus (VSV). Here the pathogen- specific T- cell re-sponse was analyzed quantitatively and qualitatively and in both cases a strong pathogen- specific immune response was observed.
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Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Medizinische Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	11.06.2018
Dateien geändert am:	11.06.2018
Promotionsantrag am:	26.01.2018
Datum der Promotion:	18.05.2018