Dokument: Investigation of Enzyme Catalysis and Protein-Ligand Interaction Using Solution-State NMR Spectroscopy

Titel:	Investigation of Enzyme Catalysis and Protein-Ligand Interaction Using Solution-State NMR Spectroscopy
Weiterer Titel:	Untersuchung der Enzymkatalyse und Protein-Ligand Wechselwirkung unter Verwendung von Flüssig-NMR-Spektroskopie
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=45900
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180509-092113-2
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Schulte, Marianne [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 42,13 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 03.05.2018 / geändert 03.05.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter]
Stichwörter:	conformational sampling, solution-state NMR, MD-simulations, enzyme, aldolase, WW-domain, Nedd4-1
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Proteine sind intrinsisch flexibl und ihre Funktion hängt sowohl von der dreidimensionalen Struktur als auch von der Dynamik ab. Proteinbewegungen sind durch eine Anzahl von Konformationen gekennzeichnet, die ständige Austauschprozesse durchlaufen. Die Charakterisierung der intrinsischen Dynamik von Proteinen gibt wertvolle Einblicke in ihre Wirkungsweise. Kernspinresonanz (NMR, engl.: Nuclear Magnetic Resonance)-Spektroskopie, ergänzt durch Moleküldynamik (MD)-Simulationen, ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung der Proteinstruktur als auch ihrer Dynamik auf atomarer Ebene. In dieser Arbeit wurde eine kombinierte NMR- und MD-Simulations Studie verwendet, um den Effekt von Struktur und Dynamik unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Proteinsystemen auf die Proteinfunktion zu untersuchen. 2-Desoxyribose-5-phosphat Aldolase (DERA) katalysiert die reversible Umwandlung von 2-Desoxyribose-5-phosphat in Acetaldehyd und Glyceraldehyd-3-phosphat (G3P) und ist im Nukleotidkatabolismus beteiligt. Die einzigartige Fähigkeit der DERA, die C-C-Bindungsreaktion zwischen zwei Aldehyden zu katalysieren, und eine breite Akzeptor-Substrat Toleranz, machen es zu einem attraktiven Biokatalysator. Der Reaktionsmechanismus der E. coli DERA (ecDERA), welche als symmetrischer Homodimer mit einer Größe von 259 Aminosäuren pro Monomer vorliegt, wurde basierend auf Kristallstrukturen des Proteins mit Reaktionsintermediaten und Mutagenese Studien postuliert. Obwohl in zahlreichen Studien die Bedeutung des C-terminalen Tyrosins (Y259) in der katalytischen Reaktion hervorgehoben wurde, blieb die strukturelle Basis der Beteiligung dieses Restes aufgrund fehlender Elektronendichte der letzten 8 bis 9 C-terminalen Reste (C-terminal Tail) verborgen. Unter Verwendung von NMR-Spektroskopie an einer Monomervariante der ecDERA und ihrer Mutanten wurde das Sampling einer katalytisch relevanten Konformation des C-terminalen Tails, wobei Y259 ins aktive Zentrum hineinreicht (geschlossener Zustand), in Abwesenheit des Substrats beobachtet. Ein signifikant populierter geschlossener Zustand führte zu Kern-Overhauser-Effekt (NOE, engl.: Nuclear Overhauser Effect)-Kreuzpeaks in NOE-Spektroskopie (NOESY) Experimenten, auf deren Grundlage die erste Struktur des C-terminalen Tails im geschlossenen-Zustands Ensemble berechnet wurde. Umfangreiche MD-Simulationen, die die NMR Ergebnisse ergänzen, wurden verwendet, um die transienten Wechselwirkungen näher zu charakterisieren, welche den C-terminalen Tail im geschlossenen Zustand stabilisieren. Darüber hinaus zeigten Wasserstoff/Deuterium-Austausch Experimente, dass die Y259 Seitenkette für eine effiziente Substrat-Proton-Abstraktion notwendig ist und somit den Imin-Enamin- Übergang im ecDERA-Reaktionsmechanismus beschleunigen könnte. Des Weiteren wurde neben der bekannten Phosphatbindungsstelle, die in ecDERA-Kristallstrukturen identifiziert wurde, eine zuvor unbekannte Hilfsbindungsstelle, welche sich am C-terminalen Tail befindet, anhand von Änderungen der chemischen Verschiebung mittels einer Phosphat Titration identifiziert. Diese Phosphatbindestelle kann die Phosphatgruppe des Substrats koordinieren, wodurch möglicherweise die optimale Position von Y259 während der katalytischen Reaktion stabilisiert wird. Humanes Nedd4-1 (hNedd4-1) (engl.: Neuronal precursor cell expressed developmentally down-regulated gene 4-1) ist eine E3-Ubiquitin-Ligase, die den Ubiquitintransfer des entsprechenden E2-Enzyms auf das Substrat vermittelt. Das erste bekannte Target von Nedd4-1 war der humane epitheliale Natriumkanal (hENaC, engl.: epithelial Na+ channel). Der charakteristische Aufbau der Nedd4-Proteine umfasst drei bis vier WW-Domänen, die zwischen einer N-terminalen C2-Domäne und einer C-terminalen HECT-Domäne liegen. Die Substratspezifität wird durch die Protein-Protein-Interaktionsdomänen, den WW-Domänen, definiert. WW-Domänen von Nedd4-1 erkennen das PPxY-Motiv des hENaC (PY-Motiv) und weisen eine hohe Sequenzähnlichkeit untereinander auf. Die Affinität zum PY-Motiv variiert jedoch signifikant, wobei die dritte WW-Domäne (WW3*) die höchste Affinität zeigt. Mit Hilfe von NMR-Spektroskopie konnte gezeigt werden, dass die WW3*-Domäne in einem Gleichgewicht zwischen einem gefalteten bindungskompetenten, und einem ungefalteten Zustand in Lösung existiert. Das PY-Motiv bindet an den bindungskompetenten Zustand und verschiebt dadurch das Gleichgewicht zum gefalteten Zustand. Die Wechselwirkung der WW3*-Domäne mit dem PY-Motiv tritt daher durch gekoppelte Faltungs- und Bindungsgleichgewichte auf. Die größte Sequenzdiversität unter den vier hNedd4-1 WW-Domänen liegt innerhalb des Loops, welcher die ersten beiden β-Faltblätter verbindet (Loop I). Loop I der WW3*-Domäne nimmt die Struktur eines Type I β-Turns an. Type I β-Turns bilden sich innerhalb von 100 ns und ermöglichen somit eine schnelle Faltung. Ein in Type I β-Turns statistisch bevorzugtes Prolin befindet sich an der i+1 Position von Loop I der WW3*- Domäne, allerdings nicht in den anderen drei hNedd4-1 WW-Domänen. Die Charakterisierung der Stabilität und der Dynamik von Loop I wurde mit einer Kombination aus NMR-Spektroskopie und MD-Simulationen durchgeführt. Der Austausch des Prolins an der i+1 Position in Loop I der WW3*-Domäne durch den entsprechenden Rest in WW4 (Threonin) führt zu einem dynamischen, aus sieben Resten bestehenden Loop I anstelle eines Type I β-Turns. Die Bindung des hENaC-Peptids stabilisiert den Type I β-Turn in Loop I, sowohl für den Wildtyp als auch für die P433T Mutante der WW3*-Domäne. Darüber hinaus verändert die P zu T Mutation in Loop I nicht nur die Stabilität von Loop I, sondern auch die Gesamtstabilität der WW3* P433T Mutante, was aus einer Abnahme der Schmelztemperatur um 6 °C ersichtlich ist. Somit ermöglicht ein Prolin in i+1 Position in Loop I einen stabilen Type I β-Turn, was die Affinität zum α-hENaC Peptid beeinflussen könnte. Proteins are intrinsically flexible and their function depends on the three-dimensional structure as well as dynamics. Protein motions are characterized by a number of conformations that constantly undergo exchange processes. Defining the intrinsic dynamics of proteins provides valuable insight into their mode of action. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy, complemented with molecular dynamics (MD) simulations, is a powerful technique to study protein structure and dynamics, at atomic resolution. In this work, a combined NMR and MD simulation study was employed to study the effect of structure and dynamics on the protein function, using two different protein systems. 2-Deoxyribose-5-phosphate aldolase (DERA) catalyzes the reversible conversion of 2-deoxyribose-5-phosphate (dR5P) into acetaldehyde and glyceraldehyde-3-phosphate (G3P) and is involved in nucleotide catabolism. Its unique ability to catalyze C-C bond formation between two aldehydes and a broad acceptor-substrate tolerance makes it an attractive biocatalyst. The reaction mechanism of the E. coli DERA (ecDERA), a symmetric homodimer with 259 amino acids per monomeric unit, has been proposed based on crystal structures of ecDERA with reaction intermediates and mutagenesis studies. Although numerous biochemical studies have highlighted the importance of the C-terminal tyrosine (Y259) in the catalytic reaction, the structural basis of its participation remained elusive due to missing electron density of the last 8 to 9 C-terminal residues (C-terminal tail) in the available crystal structures. Using NMR spectroscopy on a monomer variant of the ecDERA and its mutants, transient sampling of catalytically-relevant conformations of the C-terminal tail, where Y259 enters the active site (closed state), was observed in the absence of the substrate. A significantly populated closed state gave rise to nuclear Overhauser effect (NOE) cross-peaks in NOE spectroscopy (NOESY) experiments, based on which the first solution structure of the closed state ensemble of the C-terminal tail was derived. Extensive MD simulations, complementing the NMR results, were further used to characterize the transient interactions stabilizing the C-terminal tail in the closed state conformation. Moreover, hydrogen/deuterium exchange experiments revealed that Y259 side chain is necessary for efficient substrate-proton abstraction and thus, may facilitate the imine to enamine transition in the ecDERA reaction mechanism. Furthermore, besides the known phosphate binding site identified in ecDERA crystal structures, a previously unknown auxiliary binding site was identified, located at the C-terminal tail, using chemical shift perturbation analysis. This phosphate binding site may dock onto the substrate’s phosphate group, thereby stabilizing the optimal position of Y259 during the catalytic reaction. Human Nedd4-1 (hNedd4-1) (Neuronal precursor cell expressed developmentally down-regulated gene 4-1) is an E3 ubiquitin ligase, that mediates the transfer of ubiquitin from the cognate E2 ubiquitin-conjugating enzyme to the substrate. The first recognized target of Nedd4-1 was the human epithelial Na+ channel (hENaC). The characteristic architecture of Nedd4 family proteins comprises three to four WW domains sandwiched between an N-terminal C2 domain and a C-terminal HECT domain. Substrate specificity and affinity is defined by the protein-protein interaction domains; the WW domains. WW domains of hNedd4-1 recognize the PPxY motif from hENaC (PY motif) and have high sequence similarity amongst themselves. However, the affinities to the PY motif vary significantly, with the third WW domain (WW3*) showing the highest affinity. Using NMR spectroscopy, WW3* domain was found to exist in an equilibrium between a folded, binding-competent, and a random coil-like state in solution. The PY motif binds to the binding-competent state, thereby shifting the folding equilibrium towards the folded state. Hence, WW3*-PY motif interaction occurs through coupled folding and binding equilibria. The highest sequence diversity amongst the four hNedd4-1 WW domains lies within the loop connecting the first two β-strands (loop I). Loop I of WW3* adopts a type I β-turn. Type I turns are known to form within 100 ns, thereby allowing fast folding. A highly statistically preferred proline is found at i+1 position in loop I of WW3*, but not the other three hNedd4-1 WW domains. Characterization of loop I stability and dynamics was accomplished using a combination of NMR spectroscopy and MD simulations. Exchange of the loop I proline from WW3* domain into the corresponding residue from WW4 (threonine) resulted in a dynamic seven residue loop rather than the wild-type type I β-turn. Peptide binding, however, locks this loop in a type I β-turn for both, wild-type and P433T mutant of WW3*. Moreover, the P to T mutation in loop I not only alters loop I stability but also the overall stability of the apo-WW3* P433T mutant, evident from a 6 °C decrease in melting temperature. Therefore, presence of proline in loop I enables presence of a stable type I β-turn, which may affect the affinity towards the α-hENaC peptide.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie
Dokument erstellt am:	09.05.2018
Dateien geändert am:	09.05.2018
Promotionsantrag am:	22.12.2017
Datum der Promotion:	02.02.2018