Dokument: Genome editing and establishment of efficient gene targeting approaches in Arabidopsis using the CRISPR/Cas9 system

Titel:	Genome editing and establishment of efficient gene targeting approaches in Arabidopsis using the CRISPR/Cas9 system
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=45849
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180507-105729-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hahn, Florian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 44,28 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 07.05.2018 / geändert 07.05.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Weber, Andreas P. M. [Gutachter] Prof. Dr. Westhoff, Peter [Gutachter]
Stichwörter:	CRISPR/Cas9, Gene editing, Gene targeting, Genome Editing, Arabidopsis, C4 photosynthesis, C2 photosynthesis, glabrous, trichomes
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	The CRISPR/Cas9 system has emerged recently as a novel tool for genome editing in plants and other organisms. It relies on the targeted introduction of DNA double-strand breaks by the programmable Cas9 nuclease and subsequent exploitation of the DNA repair machinery of the host cell. Double-strand break repair can be conducted by the error-prone non-homologous end joining pathway, which frequently results in small indel mutations at the site of the double-strand break, thus leading to gene knockouts. Alternatively, a homologous DNA molecule can be used as repair template for a conservative repair by homologous recombination. This approach can be employed for targeted introduction of foreign DNA by adding an artificial repair template. This process is called gene targeting and allows highly specific manipulation of genomes. However, gene targeting frequencies are intrinsically low and require optimisation of the repair template delivery. This thesis established the gene for the trichome master regulator GLABROUS1 (GL1) as visual marker for successful CRISPR/Cas9-based genome editing. Trichome formation can be used as direct visual read out for Cas9-induced mutations. To target the GL1 gene, a generic vector system was established, which allows easy cloning of any target sequence. Finally, the GL1 gene was used as marker for comparison of two gene targeting methods. Here, stable gene targeting events could be generated in Arabidopsis using an in planta gene targeting approach. Genome editing techniques, such as the CRISPR/Cas9 system, are crucial to develop highly efficient crop varieties in times of a growing world population and loss of arable land. Plants employ photosynthesis to convert atmospheric CO2 into biomass. This process still harbours potential for optimisation. More precisely, photorespiration, which is a salvage pathway for unavoidable O2 fixation during photosynthesis, is an attractive target for optimization as it releases previously fixed CO2 and consumes ATP. C2 plants exploit the photorespiratory pathway as an efficient CO2 pump by bundle sheath cell specific expression of the GLYCINE DECARBOXYLASE P-PROTEIN, thereby minimizing the negative effects of photorespiration. Introduction of this pump into C3 plants, which represent the majority of today’s crop plants, is therefore of interest. In this thesis, the promoter of the Arabidopsis GLYCINE DECARBOXYLASE P-PROTEIN1 was modified by genome editing in order to express this protein specifically in bundle sheath cells. The generated mutants accumulated glycine and were slightly delayed in growth. The presented data provide a starting point for further characterization of these mutants and explore a promising path for engineering photorespiration. Das CRISPR/Cas9-System dient als molekularbiologisches Werkzeug zur gezielten Genveränderung und wird seit seiner Entdeckung vor einigen Jahren zunehmend in Pflanzen und anderen Organismen angewandt. Die Veränderung der genetischen Sequenz basiert auf der gezielten Einführung von DNS-Doppelstrangbrüchen durch die Aktivität der Cas9 Nuklease und der anschließenden Reparatur durch die DNS Reparaturmaschinerie der Zelle. Doppelstrangbrüche können durch den fehleranfälligen „non-homologous end joining“-Mechanismus repariert werden, der jedoch oft kleine InDel Mutationen an dem Ort des Doppelstrangbruchs einfügt. Diese Mutationen können zur Genausschaltung führen. Alternativ kann bei der homologen Rekombination ein homologes DNS Molekül als Reparaturmatrize für eine konservative Reparatur genutzt werden. Dieser Mechanismus kann durch die Hinzugabe einer künstlichen Reparaturmatrize zur Einfügung fremder DNS in einen Organismus ausgenutzt werden. Diesen Vorgang, der sehr präzise Genommodifikationen erlaubt, nennt man „Gene targeting“. Jedoch sind die „Gene targeting“-Frequenzen sehr niedrig und eine Optimierung der Reparaturmatrizenbereitstellung ist nötig. In dieser Doktorarbeit wurde das Gen für den Hauptregulator der Trichomentstehung, GLABROUS1 (GL1), als visueller Marker für erfolgreiche Genveränderungen durch das CRISPR/Cas9-System etabliert. Die Bildung von Trichomen kann so zum direkten Auslesen von Cas9-induzierten Mutationen genutzt werden. Um das GL1 Gen zu mutieren, wurde ein generisch nutzbares Vektorsystem etabliert, welches die einfache Klonierung jeder Zielsequenz ermöglicht. Außerdem wurde das GL1 Gen als Marker genutzt, um zwei „Gene targeting“-Methoden zu vergleichen. Hierbei konnten mit Hilfe der „in planta gene targeting“-Methode stabile „Gene targeting“-Ereignisse in Arabidopsis generiert werden. Manipulationen von Pflanzengenomen durch Methoden wie das CRISPR/Cas9-System sind in Zeiten einer wachsenden Weltbevölkerung wichtig, um hocheffiziente Nutzpflanzen zu erzeugen. Pflanzen nutzen die Photosynthese um CO2 in Biomasse umzusetzen. Dieser Prozess kann jedoch noch optimiert werden: Um die unvermeidbare O2-Fixierung während der Photosynthese auszugleichen, nutzen Pflanzen die Photorespiration. Diese ist ein attraktives Ziel zur Optimierung, da hierbei CO2 freigesetzt und ATP verbraucht wird. C2-Pflanzen nutzen die Photorespiration als effiziente CO2-Pumpe durch bündelscheidenzellspezifische Expression des GLYCINE DECARBOXYLASE P-PROTEIN, wodurch die negativen Effekte der Photorespiration minimiert werden. Deshalb ist das Einführen dieser Pumpe in C3-Pflanzen, die die Mehrzahl der heutigen Nutzpflanzen bilden, von großem Interesse. In dieser Arbeit wurde der Promoter des GLYCINE DECARBOXYLASE P-PROTEIN1-Gens von Arabidopsis durch das CRISPR/Cas9-System modifiziert, um dieses Gen spezifisch in Bündelscheidenzellen zu exprimieren. Die erzeugten Mutanten akkumulierten Glycin und waren leicht wachstumsverzögert. Die in dieser Arbeit präsentierten Daten können als Ausgangspunkt für eine weiterführende Charakterisierung der Mutanten genutzt werden. Außerdem zeigen sie einen vielversprechenden Weg auf, die Photorespiration zu verbessern.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	07.05.2018
Dateien geändert am:	07.05.2018
Promotionsantrag am:	11.08.2014
Datum der Promotion:	29.03.2018