Dokument: Therapeutic Knockdown of the Prion Protein

Titel:	Therapeutic Knockdown of the Prion Protein
Weiterer Titel:	Therapeutischer Knockdown des Prion-Proteins
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=45750
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180423-093820-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Victor, Julian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 25,32 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 18.04.2018 / geändert 18.04.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Riesner, Detlev [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Prion diseases are debilitating, fatal brain disorders in humans and animals. They are caused by misfolding of the endogenous prion protein (PrP) from a soluble conformational isomer PrPC to the insoluble aggregation-prone PrPSc conformation. The process culminates in the formation of large, pathogenic protein aggregates which requires the constant production of PrPC. It is for this reason that the knockdown of prion protein expression has been regarded as a viable therapeutic option. This work explores the use of the RNA-cleaving 10-23 DNAzyme as a new type of knockdown agent for the treatment of prion diseases. Similarly to ribozymes, DNAzymes consist of a catalytic core and flanking DNA segments which form double strands with the regions of the RNA adjacent to a cleavage site. Accessible target sites for DNAzyme-mediated cleavage in the prion protein mRNA were predicted in silico with the use of a sequential folding algorithm. Specifically designed DNAzymes cleave short RNA substrates with high sequence specificity. Rational adjustments to the DNAzymes enable them to perform multiple turnover cleavage. Furthermore, highly structured PrP RNA transcripts are cleaved by DNAzymes according to their in silico predicted accessibility. Unexpectedly, treatment of WAC 2 neuroblastoma cells with DNAzymes introduced into the cells did not result in an effective knockdown of prion protein expression. However, specific siRNA molecules for the same target sites lowered PrPC levels substantially. Analysis of cleavage kinetics revealed that DNAzyme activity is highly sensitive to changes in Mg2+ concentrations in the submillimolar range. The data suggest that binding of at least three Mg2+ ions is required for sizeable DNAzyme activity and the low intracellular concentration of free Mg2+ ions is most probably responsible for the failure of DNAzymes in cells. The initial aim of this work involved the delivery of DNAzymes into brain-derived cells with the use of virus-like particles (VLPs) derived from the John Cunningham virus which were prepared by NEUWAY Pharma AG in cooperation with Dr. Manninga. Because of the lacking DNAzyme activity in vivo it was attempted to deliver siRNA molecules and shRNA expression plasmids into WAC 2 cells via VLPs. However, it had to be concluded that JC virus-derived VLPs are at the present not suitable for the targeted delivery of therapeutic nucleic acids into WAC 2 cells. Although a DNAzyme-mediated knockdown of prion protein expression in cells could not be achieved the work at hand provides valuable information about the characteristics and mode of action of DNAzymes, especially in respect to their Mg2+ ion dependency. Furthermore, highly potent siRNAs and shRNA expression plasmids were developed. These knockdown agents could serve as a basis for therapeutic strategies for the treatment of prion diseases. In this regard, future efforts should be directed at developing DNAzymes with a lower Mg2+ ion dependency and combining siRNAs and shRNA expression plasmids with the plethora of techniques that are being developed for the targeted delivery of therapeutics to the brain. Prionenerkrankungen sind neurodegenerative Leiden mit tödlichem Verlauf bei Mensch und Tier. Sie werden durch die Fehlfaltung des körpereigenen Prion-Proteins (PrP) von einer löslichen Konformation (PrPC) in eine unlösliche Konformation (PrPSc) ausgelöst. Das fehlgefaltete Protein aggregiert zu pathogenen Protein-Ablagerungen. Da für das Ausbilden dieser Ablagerungen die anhaltende Produktion weiterer PrPC-Monomere unabdingbar ist, wurde eine Reduktion der Prion-Protein-Expression als therapeutische Maßnahme vielfach in Betracht gezogen. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit dem RNA-spaltenden 10-23 DNAzym, welches ähnlich wie Ribozyme Doppelstränge mit einer RNA-Zielsequenz ausbildet und diese mithilfe eines katalytischen Zentrums zwischen den beiden Segmenten spaltet. Potenzielle DNAzym-Schnittstellen innerhalb der mRNA des Prion-Proteins wurden in silico auf ihre Zugänglichkeit hin untersucht. In einer ersten Serie wurden kurze RNA-Substrate von speziell konzipierten DNAzymen sequenzspezifisch gespalten. Die DNAzyme können für eine katalyische Verwendung angepasst werden, sodass die Spaltung von RNA-Substraten im Überschuss gewährleistet ist. Auch strukturierte PrP-RNA-Transkripte werden durch diese DNAzyme gespalten. Dabei stimmt die Effizienz der Spaltung mit der zuvor ermittelten Zugänglichkeit der Schnittstellen überein. Die Behandlung der Zelllinie WAC 2 mit eingeschleusten DNAzymen resultiert unerwarteterweise nicht in einer Reduktion des exprimierten PrPC, während der Einsatz entsprechender siRNA und von einem Plasmid exprimierter shRNA den PrPC-Spiegel beträchtlich senkt. Kinetische Untersuchungen zeigen dass die Aktivität des DNAzyms drastisch von der Mg2+-Konzentration abhängt. Für die Aktivität des DNAzyms ist die Bindung von mindestens drei Mg2+-Ionen notwendig. Diese Ergebnisse legen den Schluss nahe, dass unter anderem die geringe Konzentration an freiem Mg2+ für die geringe Aktivität der DNAzyme in Zellen verantwortlich ist. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war es, in Zusammenarbeit mit Dr. Manninga (NEUWAY Pharma AG) virusartige Partikel (VLPs) auf ihre Fähigkeit hin zu untersuchen, therapeutische Nukleinsäuren in Zellen einzuschleusen. Dabei wurden anstatt der ursprünglich vorgesehenen DNAzyme hochpotente siRNA-Moleküle und shRNA-Expressions-Plasmide eingesetzt. Umfangreiche Versuche mit den von der NEUWAY Pharma AG präparierten VLPs waren für das vorliegende Zellmodell zur Zeit noch nicht erfolgreich. Die in dieser Arbeit durchgeführten Experimente erlauben einen detaillierten Einblick in die Prinzipien die der Aktivität des DNAzyms zugrunde liegen. Insbesondere wurden wertvolle Daten bezüglich der Abhängigkeit des DNAzyms von Mg2+-Ionen erhalten. Die siRNA-Moleküle und shRNA-Expressions-Plasmide, die in dieser Arbeit entwickelt wurden, bilden eine Grundlage für zukünftige Behandlungsmöglichkeiten für Prionenerkankungen. DNAzyme müssten so modifiziert werden, dass sie eine geringere Abhängigkeit von Mg2+-Ionen ausweisen. Eine umfangreiche Methodik zum gehirnspezifischen Wirkstofftransport muss mit diesen Molekülen kombiniert werden.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	23.04.2018
Dateien geändert am:	23.04.2018
Promotionsantrag am:	07.12.2017
Datum der Promotion:	23.01.2018