Dokument: Die Effekte von Fernpräkonditionierung und myokardialer Ischämie auf die Expression von brain derived neurotrophic factor (BDNF) im Rattenherz und Untersuchungen zur Interaktion von BDNF und microRNA-1
| Titel: | Die Effekte von Fernpräkonditionierung und myokardialer Ischämie auf die Expression von brain derived neurotrophic factor (BDNF) im Rattenherz und Untersuchungen zur Interaktion von BDNF und microRNA-1 | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=45676 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20180418-120635-7 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Stachuletz, Friederike [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | PD Dr. med Brandenburger, Timo [Gutachter] Prof. Dr. med. Akhyari, Payam [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Die myokardiale Ischämie ist die Haupttodesursache in Deutschland. Es wurden verschiedene therapeutische Strategien entwickelt, um den Myokardschaden zu reduzieren. Hierzu zählt die ischämische Fernpräkonditionierung des Herzens (remote ischemic preconditioning, RIPC): Durch wiederholte, kurze Ischämien der peripheren Skelettmuskulatur wird der Schaden einer nachfolgenden Ischämie am Myokard verringert. Die molekularen Mechanismen, die im Rahmen der RIPC zur Myokardprotektion führen, sind nicht vollständig identifiziert. Wir konnten zeigen, dass die muskelspezifische Micro-RNA-1 (miR-1) nach RIPC im Myokard verändert exprimiert wird. Der brain derived neurotrophic factor (BDNF), ein Neurotrophin, gilt als mögliches Zielgen der miR-1.
Ziel der Arbeit war es zu untersuchen, ob 1.) die Gen- und Proteinexpression von BDNF im Myokard im Rahmen der RIPC, äquivalent zur veränderten miR-1-Expression, modifiziert ist und 2.) BDNF als Zielgen der miR-1 verifiziert werden kann. Männliche Wistar-Ratten wurden in 4 Gruppen randomisiert (n=6): Scheinoperation, RIPC, Kombination aus RIPC mit Ischämie und Reperfusion (I/R) sowie I/R allein. Die Gewebeentnahme erfolgte nach 120 Minuten Reperfusion. Aus den myokardialen Gewebeproben wurde RNA isoliert und mittels real-time PCR (qPCR) wurden die Veränderungen in der BDNF-Genexpression bei Ischämiegeschehen überprüft. Die Identifikation von BDNF als mögliches Zielgen der miR-1 erfolgte softwaregestützt mittels TargetScan. Als Interaktionsnachweis wurde ein Luciferase-Reporter-Assay mit Kotransfektion der miR-1 und den putativen Bindungsstellen in der BDNF mRNA in HEK-293-Zellen durchgeführt. Als Kontrolle diente die Kotransfektion der miR-1 und einer mutierten Bindungsregion. Die Messung der Luciferase-Aktivität erfolgte nach 48 h. Die Veränderungen der BDNF-Proteinexpression wurden mittels ELISA im Myokard der Versuchstiere und nach lentiviraler Transduktion der miR-1 aus dem Zellüberstand von ubiquitär BDNF-exprimierenden U87-Zellen gemessen. Statistik: t-Test, p<0,05. Nach 120 Minuten Reperfusion zeigte sich in der qPCR eine 4-fach höhere BDNF-Genexpression nach I/R kombiniert mit RIPC, im Vergleich zur Kontrollgruppe. Auch in der AAR der I/R-Gruppe war die Expression der BDNF mRNA setwa 3-fach erhöht. Die TargetScan-Analyse zeigte drei putative Bindungsstellen zwischen der miR-1 und der mRNA von BDNF. Kotransfektion von miR-1 und den putativen Bindungsstellen der mRNA des BDNF in HEK 293-Zellen führte zu einer signifikanten Abnahme des Luciferase-Signals auf 31% im Vergleich zum mutierten Kontrollplasmid. Im ELISA der myokardialen Gewebeproben zeigte sich keine signifikant veränderte Proteinexpression des BDNF nach RIPC. Im ELISA des Zellüberstands nach lentiviraler miR-1-Transduktion in U87-Zellen zeigte sich eine signifikant geringere BDNF-Expression (Faktor 0,5) im Vergleich zur Transduktion mit einem Kontrollvektor. Zum ersten Mal konnte BDNF als mögliches Zielgen der miR-1 identifiziert und eine Interaktion zwischen miR-1 und BDNF in vitro nachgewiesen werden. Die veränderte BDNF-Genexpression bestätigt die Involvierung des Moleküls in die molekularen Prozesse bei I/R und RIPC. Die Ergebnisse sind die Grundlage für weitere Untersuchungen und zukünftig zu möglichen therapeutischen Strategien im Hinblick auf die Protektion des Myokards durch ischämische Ereignisse.Myocardial ischemia is one of the main causes of death in Germany. In order to minimize ischemic myocardial injury it is necessary to develop therapeutic strategies. One of these strategies is termed remote ischemic preconditioning (RIPC): repeated short ischemia of peripheral skeletal muscle reduces the injury of a subsequent myocardial ischemia. The molecular mechanisms leading to myocardial protection within the context of RIPC are not fully identified. We were able to show that muscle-specific micro-RNA-1 (miR-1) is differentially expressed in the myocardium after RIPC. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF), a neurotrophin, could be a potential target gene of miR-1. The aim of the study was to investigate whether 1.) gene and protein expression of BDNF in the myocardium is modified within the context of RIPC, according to altered miR-1 expression and 2.) BDNF can be confirmed as a target gene of miR-1. Male Wistar rats were randomly assigned to 4 groups (n=6): sham operation, RIPC, combination of RIPC with ischemia and reperfusion (I/R), and I/R alone. Myocardial tissue was extracted after 120 min of reperfusion. RNA was isolated from the myocardial tissue samples and reverse transcribed into DNA. Altered BDNF mRNA expression was analyzed by real-time PCR (qPCR). Target Scan was used to predict BDNF as a possible target gene of miR-1. To verify the possible interaction between BDNF and miR-1, luciferase-reporter assay was performed with cotransfection of miR-1 and the putative binding sites in BDNF mRNA in HEK-293 cells. Cotransfection of miR-1 and a mutated binding region served as negative control. Activity of Luciferase was measured after 48 h. Changes in BDNF protein expression were measured by ELISA in rat myocardium and in cell supernatant of ubiquitous BDNF-expressing U87 cells after lentiviral transduction of the miR-1. Statistical analysis: t-test, p <0.05. After 120 minutes of reperfusion I/R combined with RIPC led to a four-fold upregulation of BDNF mRNA expression compared to the control group. In the AAR of the I/R group, BDNF mRNA expression was 3-fold upregulated. TargetScan analysis showed three putative binding sites between miR-1 and BDNF mRNA. Cotransfection of miR-1 and the putative binding sites of BDNF mRNA in HEK 293 cells led to a significant decrease of the luciferase signal to 31% compared to cotransfection of miR-1 and the mutated control plasmid. There was no alteration of BDNF protein expression in myocardium measured by ELISA. ELISA of cell supernatant after lentiviral miR-1 transduction in U87 cells showed significantly decreased BDNF protein expression (factor 0.5) compared to transduction with an empty control vector. For the first time BDNF was identified as possible target gene of miR-1 and an interaction between miR-1 and BDNF was detected in vitro. Altered BDNF gene expression confirms the involvement of BDNF in the molecular processes of I/R and RIPC. The results represent an important approach to further studies and in the future to possible therapeutic strategies for myocardial protection in the context of ischemic events. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 18.04.2018 | |||||||
| Dateien geändert am: | 18.04.2018 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 31.05.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 10.04.2018 |
