Dokument: The effect of the Leu33Pro polymorphism on platelets phenotype

Titel:	The effect of the Leu33Pro polymorphism on platelets phenotype
Weiterer Titel:	Die Auswirkung des Leu33Pro Polymorphismus auf den Phänotyp der Thrombozyten
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=45549
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180409-081015-6
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	MSc Ventura Pereira, Joana Patrícia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 6,82 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 06.04.2018 / geändert 06.04.2018
Beitragende:	Prof. Dr. med. Stöcklein, Nikolas H. [Gutachter] Prof. Dr. Martin, William F. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Das Rezeptorintegrin αIIbβ3 spielt eine Schlüsselrolle in der Plättchenkoagulation und Hämostase. In Position 33 der β3 Untereinheit sind zwei Varianten - Leu33 (HPA-1a) und Pro33 (HPA1b) – bekannt. Klinische epidemiologische Studien deuten auf eine Assoziation zwischen der HPA-1b-Variante und einem erhöhten Risiko für einen Myokardinfarkt bei Pati-enten mit koronarer Herzkrankheit hin. Das Postulat eines prothrombotischen Charakters der HPA-1b-Variante wird durch diverse Funktionsstudien gestützt. Es fehlt jedoch an Wissen zu den Unterschieden in der Struktur-Funktionsbeziehung zwischen beiden Varianten des Leu33Pro-Polymorphismus. Speziell die Wechselwirkungen zwischen den Liganden des po-lymorphen αIIbβ3-Rezeptor sind weitest gehend unklar. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war, diese Lücken zu füllen. Es sollte eine Verbindung zwischen den publizierten Funktionsstudien und den beschriebenen klinischen epidemiologischen Studien gefunden werden. Für die Untersuchungen wurde ein Modell auf der Grundlage der transienten Expression des Integrins αIIbβ3 als fluoreszierende Fusionsproteine in HEK293-Zellen aufgebaut. Durch den Förster(Fluoreszenz)-Resonanz-Energie-Transfer und in Verbindung mit dem Akzeptor Photobleaching (FRET-APB) konnte mit diesem Modell gezeigt werden, dass bereits im ruhenden Rezeptorzustand die zytoplasmatischen Domänen („Beine“) der α- und β-Untereinheiten in der Pro33-Variante weiter voneinander entfernt sind als in der Leu33-Variante. Eine Bestättigung dieses Befunds lieferte eine unabhängige Studie mittels digitaler Strukturberechnungen. Somit wurde deutlich, dass das dynamische Konformationsgleichgewicht des αIIbβ3-Integrins hin zu einer offeneren Konformation in der Pro33-Variante begünstigt wird und die weitgespreizten zytoplasmatischen „Beine“ dem aktiven Rezeptorzustand näher kommen als in der Leu33-Konformation. Der Polymorphismus in der Ektodomäne entfaltet somit eine allosterische Wirkung auf die zytoplasmatischen „Beine“. Die zellulären Konsequenzen zu diesen Befunden wurden mittels Einzelzell-Kraftspektroskopie (SCFS) betrachtet, da Zellen der Pro33-Variante stärker und stabiler an immobilisiertes Fibrinogen binden als Zellen der Leu33-Variante. Zusammenfassend zeigen die Strukturanalysen, dass die Pro33-Variante der β-Un-tereinheit (HPA-1b) Einfluß auf die Struktur des Integrins hat, der die Merkmale einer Re-zeptorvoraktivierung trägt und somit auf einen prothrombotischen Charakter hindeuten. Gestützt wird diese Beobachtung, durch das Struktur-Funktion-Korrelat einer gesteigerten Avidität der Pro33-Rezeptorvariante zu seinem prominentesten Liganden - dem Fibrinogen. The receptor integrin αIIbβ3 expressed in platelets plays a key role in physiological processes as coagulation and haemostasis. The β3 subunit of the receptor has two diferent isoforms differing in the amino acid residue at position 33, on the human platelet antigen 1 (HPA-1). The isoform containing a Leucine (HPA-1a) is considered the wild type while the isoform containing a Proline (HPA-1b) has been associated with increased risk of myocardial infarction in patients with coronary disease. Dispersed functional studies support the prothrombotic character of HPA-1b, however there is still a lack of knowledge on the impact of the Leu33Pro polymorphism in αIIbβ3 receptor´s structure and function, namely in its capacity to interact with ligands. The aim of the present work was to fill these gaps and find a relation between the functional and the clinical epidemiological observations available. We have constituted a model based on the transient expression of the two isoforms of integrin αIIbβ3 in HEK293 cells, in which the tails of both subunits were fused to fluorescent proteins. We have used Förster/Fluorescence Resonance Energy Transfer by the acceptor photobleaching (FRET-APB) to study the distances between the subunits and we could observe that in the resting state the cytoplasmic tails of α and β subunits are more separated in the Pro33 variant. Using Single-cell Force Spectroscopy (SCFS), we could observe that cells expressing the Pro33 variant bind more strongly and stably to immobilized fibrinogen, the main natural ligand of αIIbβ3 integrin. Collectively, the results show that the Leu33Pro polymorphism, despite situated in the ectodomain, has an allosteric effect resulting in global structural changes. Our results suggest that these changes favor ligand binding in a way that can promote the outside-in signalling pathway necessary for platelet spreading, aggregation and thrombi formation. These results complement all-atom Molecular Dynamic (MD) simulations showing that the Pro33variant of αIIbβ3 shifts the dynamic conformational equilibrium of αIIbβ3 integrin towards a more open and extended state, resembling more the active state. In conclusion, the results of this work provide new mechanistic insights and a new basis for understanding the prothrombotic character of the αIIbβ3Pro33 receptor reported in previous functional and clinical studies.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	09.04.2018
Dateien geändert am:	09.04.2018
Promotionsantrag am:	04.12.2017
Datum der Promotion:	15.02.2018