Dokument: Evaluation von Biomarkern für die präklinische Bestimmung immunmodulatorischer und immuntoxischer Effekte

Titel:	Evaluation von Biomarkern für die präklinische Bestimmung immunmodulatorischer und immuntoxischer Effekte
Weiterer Titel:	Evaluation of biomarker for immunomodulating and immunotoxic effects in preclinical studies
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=45306
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180322-081836-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kemmerling, Jessica [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 7,95 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 21.03.2018 / geändert 21.03.2018
Beitragende:	PD Dr. Vohr, Hans-Werner [Gutachter] Prof. Dr. Eckhard Lammert [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	In der präklinischen Entwicklung von Medikamenten und bei der toxikologischen Testung von Chemikalien ist eine frühzeitige Abschätzung der Immuntoxizität, das heißt die Untersuchung von unerwünschten Nebenwirkungen auf die Immunfunktion von Versuchstieren, ein wichtiger Bestandteil der Risikoabschätzung für den Menschen. Immuntoxikologische Untersuchungsmethoden beinhalten unter anderem die Histopathologie von lymphatischen Organen und Knochenmark, Subpopulationsanalysen, Hämatologie und Zytologie. Aus allen Untersuchungen müssen die empfindlichsten Methoden bestimmt werden, die einen Schwellenwert ableiten lassen, bei dem in der höchsten Dosis kein (adverser) toxischer Effekt auftritt [NO(A)EL]. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, Immunbiomarker im Rahmen von oralen 28-Tage Toxizitätsstudien gemäß der OECD Test-Richtlinie Nr. 407 an Ratten mit Hilfe neuer Methoden zu etablieren, um die Bewertung von Substanzen bzgl. der Immuntoxizität zu optimieren. Im ersten Schritt wurden immunhistochemische Biomarker (Färbung der wichtigsten Immunzellen und interagierenden Zellen) in lymphatischen Organen an archivierten Material von 14 - 28-Tage Toxizitätsstudien in der Ratte etabliert. Die verabreichten Testsubstanzen in diesen Studien waren bekannte immunmodulatorische Substanzen: Die Immunsupressiva Azathioprin und Cyclosporin A, Entwicklungssubstanzen aus der Antibiotikagruppe der Oxazolidinone und zwei Umweltchemikalien, Benzo[a]pyren und Hexachlorbenzol. Im zweiten Schritt wurden die gewonnen Erfahrungen in einer neu geplanten oralen 28-Tage Toxizitätsstudie an Ratten mit Cyclosporin A und Azathioprin angewandt. Neben den Routineprüfungen zur Immuntoxizität und den immunhistochemischen Biomarker, wurden in dieser Tierstudie neue state-of-the-art Methoden zur Untersuchung von Knochenmarkstoxizität (automatisch, manuell zytologisch und in vitro) verglichen. Der Nachweis hämatotoxischer Effekte mittels Biomarkern ist von großem Interesse, da die mikroskopische Auswertung von Knochenmark zeitintensiv ist und ein enormes Expertenwissen erfordert. Die immunhistochemischen Biomarker in Kombination mit der Terminologie der Enhanced Histopathology (= semiquantitative deskriptive Befundung separater Kompartimente in lymphatischen Organen) in Milz und Thymus konnten in den meisten Studien (sowohl archiviertes als auch frisches Gewebe) zelluläre Veränderungen empfindlicher bestimmen als die routinemäßig angewandte H&E-Färbung.   Die immunhistochemische Untersuchung eignet sich gut in der ersten Teststufe zur Immuntoxiziät in Routinestudien zusammen mit der H&E-Färbung sowie weiteren studienspezifischen Parametern wie Organgewichten und hämatologischen Parametern. Sie kann die Ableitung von Schwellenwerten unterstützen und mechanistische Informationen liefern. Für mechanistische Untersuchungen erwies sich zusätzlich die konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie für zelluläre Details besonders vielversprechend. Des Weiteren konnten neue Darstellungsarten die großen Datenmengen aus den toxikologischen Standarduntersuchungen und den immunhistochemischen Ergebnissen übersichtlich zusammenfassen und vereinfachten die Interpretation von Effekten. Die Heatmap-Darstellung visualisiert in farblicher Weise zusammenhängende Effekte und Einzeleffekte. Die Hauptkomponentenanalyse stellt dagegen in einem dreidimensionalen Koordinatensystem Ausreißer dar und kann Unterschiede im Wirkmechanismus verschiedener Substanzen aufzeigen. Hinsichtlich der verschiedenen Knochenmarksuntersuchungen ist festzustellen, dass das anfängliche Ziel, die beschwerliche manuelle Knochenmarksdifferenzierung durch eine einfachere und schnellere Methode zu ersetzen nicht erreicht werden konnte. Als Ergänzung ist eine automatische Knochenmarkszelldifferenzierung wünschenswert, die aber mit dem Hämatologie-System Advia 2120i weiter validiert werden müsste, da nicht alle Zelltypen sicher klassifiziert wurden. Die FACS-Analyse ist eine gute und etablierte Methode für die Messung von spezifische Zellpopulationen und könnte zukünftig als ex vivo Screening-Methode und Ersatz von manueller Knochenmarksdifferenzierung fungieren. Eine vielversprechende Alternative zum Tierversuch ist der in vitro CFU (colony-forming unit)-Assay, der einen Vergleich zwischen humanen und aus der Ratte stammenden Knochenmarkszellen ermöglicht und dosisabhängige Effekte aufzeigt. Dieser Test könnte als erstes Screening ohne die Verwendung von Tieren zur Untersuchung einer Hämatotoxizität angewandt werden. Insgesamt ist für die Identifizierung von immuntoxischen oder immunmodulierenden Effekten von Chemikalien oder Medikamenten in präklinischen Studien die Durchführung mehrerer Tests erforderlich, die anschließend mit einer weight-of-evidence Betrachtung interpretiert werden. Hierbei können zuverlässige Immunbiomarker zu einer schnellen und sensitiven Bewertung beitragen. An Early assessment of immunotoxicity (the investigation of adverse health effects as a result of the interaction of xenobiotics with the immune system) is an important part in the preclinical development of drugs and in the toxicological testing of chemicals. Immunotoxicity testing includes, among others, histopathology of lymphoid organs, subpopulation analysis, hematology and cytology. From all investigations the most sensitive methods have to be found, which indicate a threshold value at which no-observed-(adverse)-effect level NO (A) EL is found at the highest dose tested. The aim of this thesis was to establish immunobiomarkers in oral 28-day toxicity studies according to OECD Test Guideline No. 407 in rats in order to optimize the assessment of immunotoxic substances according to international guidelines by the application of newly established methods. In the first step, immunohistochemical biomarkers were established in lymphoid organs in archived material of 14 - 28-day toxicity studies in the rat. The test samples were well-known immunomodulators: the immunosuppressants azathioprine and cyclosporine A, development candidates from the antibiotic group of the oxazolidinones, and the two environmental chemicals benzo [a] pyrene and hexachlorobenzene. In a second step, the applied methods was extended to a newly planned oral 28-day toxicity study with cyclosporine A and azathioprine. In addition to the routine testing for immunotoxicity and use of immunohistochemical biomarkers, new state-of-the-art methods for evaluating bone marrow toxicity were included. Today, the detection of hematotoxic effects via biomarkers is of great interest since the microscopic evaluation of bone marrow is time-consuming and requires enormous expert knowledge. To enable comparison different bone marrow techniques (automatic, manual visual and in vitro) were carried out in addition. The immunohistochemical biomarkers in spleen and thymus, in combination with the terminology of Enhanced Histopathology (= semiquantitative descriptive terminology to characterize separate compartments of lymphoid organs), were found to be more sensitive in most of the studies in detecting cellular changes when compared with routine H&E staining.This examination is well-suited for the first step of immunotoxicity testing in routine, supports the derivation of thresholds for risk assessment and provides mechanistic information. In addition, for mechanistic investigations confocal laser scanning microscopy turned out to be particularly promising for cellular details.   Furthermore, new ways in which standard toxicological studies and the immunohistochemical results can be presented were useful to manage large amounts of data and thus to simplify the interpretation of effects. The heatmap representation clearly visualizes synergistic and individual effects. The principal component analysis (displayed as a three-dimensional coordinate system) helps to identify outliers and could show differences in the mechanism of action of various substances. With regard to the different bone marrow examinations, it should be noted that the initial goal of replacing the cumbersome manual bone marrow differentiation by a simpler and faster method is not possible so far. An automatic bone marrow cell differentiation is also desirable, but the hematology system Advia 2120i has to be more extensively validated due to its weaknesses in identification of some cell populations. The FACS analysis is a reliable and established method for the measurement of specific cell populations and could function in future as an ex vivo screening method and replacement of manual bone marrow differentiation. A promising alternative to the animal experiment is the in vitro CFU (colony-forming unit) assay, which allows a comparison between human and rat bone marrow cells and shows dose-dependent effects. This test could be used as a first screening step avoiding the use of animals for the investigation of hematotoxicity. Overall, the identification of immunotoxic or immunomodulatory effects of chemicals or drugs in preclinical studies requires the implementation of several tests and the subsequent interpretation with a weight-of-evidence approach. For this purpose, reliable immunobiomarkers can contribute to a rapid and sensitive immunotoxicity assessment.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie
Dokument erstellt am:	22.03.2018
Dateien geändert am:	22.03.2018
Promotionsantrag am:	15.09.2017
Datum der Promotion:	25.01.2018