Dokument: Einfluss einer an der Rattenleber induzierten warmen partiellen Ischämie mit Reperfusion und einer ischämischen Präkonditionierung auf das hepatische zytosolische Phosphoproteom
| Titel: | Einfluss einer an der Rattenleber induzierten warmen partiellen Ischämie mit Reperfusion und einer ischämischen Präkonditionierung auf das hepatische zytosolische Phosphoproteom | |||||||
| Weiterer Titel: | Influence of a warm partial Ischemia with reperfusion induced in a rat liver and ischemic preconditioning on the hepatic cytosolic phosphoproteome | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=45222 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20180316-093923-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Stelzner, Felix [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Bauer, Inge [Gutachter] PD Dr. Thelen, Simon [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | Im klinischen Alltag wird die Leber in verschiedenen Situationen einer Ischämie und einer darauffolgenden Reperfusion (IR) ausgesetzt. Sowohl die Ischämie als auch die Reperfusion führen zu einem hepatozellulären Schaden. Die ischämische Präkonditionierung (IPC) ist ein Verfahren, welches einen IR-induzierten Schaden
reduziert. Durch eine kurze, subletale IR wird die Toleranz des Gewebes gegen einen IRSchaden gesteigert. Die molekularen Mechanismen, die zu dieser Organprotektion führen, sind nur zum Teil verstanden. Es existieren Hinweise auf eine Beteiligung posttranslationaler Proteinmodifikationen. Ziel dieser Arbeit war es, den Einfluss hepatischer IR und IPC auf das hepatische zytosolische Proteom und Phosphoproteom zu analysieren. Männliche Wistar Ratten wurden hierzu operiert und eine partielle, warme Leberischämie induziert. Die IPC bestand aus zehn Minuten Ischämie, gefolgt von zehn Minuten Reperfusion. Die IR bestand aus 60 min Ischämie und 60 min Reperfusion. Zu zwei Untersuchungszeitpunkten, unmittelbar nach Beendigung der IPC und nach Beendigung der IR bzw. zu den entsprechenden Zeitpunkten bei schein-operierten Kontrollen wurde Lebergewebe zur Proteinanalytik entnommen. Mittels differentieller Zentrifugation erfolgte eine subzelluläre Fraktionierung. Die zytosolischen Proteine wurden isoliert und mittels 2D-Gelelektrophorese aufgetrennt. Die sequentielle Färbung der 2D-Gele mit der ProQ Diamond Phosphoprotein Gel Stain (ProQ-DPS) und einer hochsensitiven Coomassie-Färbung ermöglichte die Analyse differentieller Phosphorylierung bzw. Expression von Proteinen. Differentiell regulierte Proteine wurden mittels Electrospray ionization (ESI) Massenspektrometrie sowie mittels Orbitrap Massenspektrometrie, gekoppelt mit einer Ultra high performance liquid chromatography (UHPLC) identifiziert. IPC führte zu einer signifikanten Reduktion des IR-Schadens, bestimmt anhand der Transaminasen im Serum. Insgesamt wurden 21 Phosphoproteinspots und 12 Coomassie-gefärbte Proteinspots differentiell reguliert. Hierbei hatte der zeitliche Verlauf des operativen Eingriffs den größten Einfluss auf die Phosphorylierung und Expression zytosolischer Proteine. Unter anderem wurden die 5- Oxoprolinase und die Carbamoylphosphat Synthase 1 vermindert und der eukaryote Elongationsfaktor 2 (eEF2) und das Hitzeschockprotein 60 vermehrt exprimiert. Der eEF2 und die Pyruvatkinase R/L wurden im zeitlichen Verlauf der Operation vermehrt und die Nicotinamidadenindinukleotid Kinase 2 und Regucalcin vermindert phosphoryliert. Unmittelbar nach der IPC ließ sich eine 4,3-fach vermehrte Expression von Serotransferrin feststellen. Eine IPC-induzierte differentielle Phosphorylierung ließ sich nicht detektieren. 15 differentiell regulierte Phosphoproteinspots und sechs differentiell regulierte Coomassie-gefärbte Proteinspots konnten aufgrund zu geringer Abundanz nicht massenspektrometrisch identifiziert werden. Es lässt sich schlussfolgern, dass das hepatische Proteom und Phosphoproteom in besonderem Maße von der Operation selbst beeinflusst wurde. Die vermehrte Expression von Serotransferrin lässt sich als IPCinduzierter antioxidativer Mechanismus der Leber interpretieren. Um die Bedeutung der identifizierten differentiellen Expression oder posttranslationalen Phosphorylierungen auf funktioneller Ebene zu erforschen, sind weiterführende Studien, z.B. mit entsprechenden Inhibitoren oder Aktivatoren, notwendig.In clinical practice the liver is exposed to ischemia and subsequent reperfusion (IR) in various situations. Both ischemia and reperfusion lead to hepatocellular damage. Ischemic preconditioning (IPC) is a method, which reduces an IR-induced damage. A short sublethal IR increases the tolerance of the tissue against IR damage. The molecular mechanisms leading to this organ defense are only partially understood. There is evidence of the involvement of posttranslational protein modifications. The aim of this study was to analyze the influence of hepatic IR and IPC on the hepatic cytosolic proteome and phosphoproteome. Male Wistar rats underwent surgery and a partial warm hepatic ischemia was induced. IPC consisted of ten minutes of ischemia, followed by ten minutes of reperfusion. IR consisted of 60 min of ischemia and 60 min of reperfusion. Immediately after the IPC stimulus and after IR and at the corresponding time points in sham-operated controls, liver tissue was removed for protein analysis. By means of differential centrifugation subcellular fractionation was performed. The cytosolic proteins were isolated and separated by 2D gel electrophoresis. The sequential staining of the 2D gels with the ProQ Diamond Phosphoprotein Gel Stain (ProQ-DPS) and a highly sensitive Coomassie staining enabled the analysis of differential phosphorylation and expression of proteins. Differentially regulated proteins were identified by means of electrospray ionization (ESI) mass spectrometry as well as by orbitrap mass spectrometry coupled with ultra high performance liquid chromatography (UHPLC). IPC resulted in a significant reduction of IR damage determined by serum transaminases. A total of 21 phosphoprotein spots and 12 Coomassie-stained protein spots were differentially regulated. The temporal course of the surgical procedure had the greatest influence on the phosphorylation and expression of cytosolic proteins. 5-oxoprolinase and carbamoyl phosphate synthase 1 were reduced and eukaryote elongation factor 2 (eEF2) and heat shock protein 60 were expressed more intensively. EEF2 and pyruvate kinase R/L showed a higher phosphorylation status during the course of the operation. Phosphorylation of nicotinamide-adenine-dinucleotide kinase 2 and regucalcine was decreased. Immediately after IPC a 4.3-fold increased expression of serotransferrin could be observed. An IPC-induced differential phosphorylation could not be detected. 15 differentially regulated phosphoprotein spots and six differentially regulated Coomassie-stained protein spots could not be identified by mass spectrometry due to insufficient abundance. It can be concluded that the hepatic proteome and phosphoproteome was particularly influenced by the operative intervention itself. The increased expression of serotransferrin can be interpreted as an IPC-induced antioxidant mechanism of the liver. To investigate the significance of the identified differential expression or post-translational phosphorylation at a functional level further studies, e.g. with inhibitors or activators, are necessary. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 16.03.2018 | |||||||
| Dateien geändert am: | 16.03.2018 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 29.06.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 06.03.2018 |
