Dokument: Identification of a Human Cytomegalovirus-encoded Jak1 antagonist using a novel screening strategy

Titel:	Identification of a Human Cytomegalovirus-encoded Jak1 antagonist using a novel screening strategy
Weiterer Titel:	Identifizierung eines humanen Cytomegalovirus-kodierten Jak1 Antagonisten mittels einer neuartigen Screeningstrategie
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=45108
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190429-103222-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Howe, Sebastian [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 4,14 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 07.03.2018 / geändert 07.03.2018
Beitragende:	Prof. Dr. med. Hengel, Hartmut [Gutachter] Prof. Dr. Hegemann, J. H. [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	To alleviate antiviral activities of the immune system, viruses express antagonists which often operate by degradation of specific cellular proteins. Viruses with large genomes (like human cytomegalovirus [HCMV]) often encode several genes each of which counteracts a single component of immunity (e.g. interferon [IFN] signal transduction). HCMV induces selective proteasomal degradation of janus kinase (Jak) 1 – a key factor of IFN signaling. To identify viral gene products which induce degradation of defined target proteins, we devised, established, and validated a broadly applicable forward genetic screening approach. To translate degradative forces into a survival advantage, the HSV thymidine kinase (HSV-TK) was used which activates the prodrug Ganciclovir (GCV), leading to cell death. The target proteins (e.g. Jak1) were fused to HSV-TK. Stable transfection of the respective viral antagonist destabilizes the construct, abrogating TK-activity and allowing cell proliferation in the presence of GCV due to its detoxification effect. Cell lines expressing fusion chimeras composed of TK and Jak1 or STAT2 were generated and found to be highly susceptible towards GCV. The approach was validated using the known IFN signaling inhibitors pM27 and the V protein of parainfluenza virus type 2. The screening was applied using a plasmid-based HCMV ORFeome library and a novel lentivirus-based HCMV cDNA library. Surviving cell lines were selected and enriched genes were identified by PCR. One gene product, gpUL42, reduced Jak1 amounts in co-transfection experiments. A HCMV knock-out mutant lacking the respective gene exhibited delayed Jak1 degradation kinetics compared to wild-type HCMV, indicating on the one hand that the gene product contributes to JAK1 degradation and on the other hand that further HCMV JAK1 antagonists must exist. Viren exprimieren Antagonisten, die spezifische zelluläre Proteine abbauen um die Aktivitäten des Immunsystems zu verringern. Viren mit großen Genomen (z.B. das humane Zytomegalovirus [HCMV]), kodieren oftmals mehrere Gene, die einem speziellen Teil der antiviralen Immunität (z.B. der Interferon-[IFN] Signaltransduktion) entgegenwirken. HCMV induziert selektiv den proteasomalen Abbau der janus kinase (Jak) 1 – einem entscheidenden Protein des IFN Signalweges. Um virale Genprodukte, die einen Abbau von definierten Zielproteinen veranlassen, zu identifizieren, haben wir einen umfassend anwendbaren genetischen Screen erdacht, etabliert und validiert. Hierfür wurde die herpesvirale Thymidinkinase (HSV-TK) verwendet, welche die Prodrug Ganciclovir (GCV) aktiviert und damit den Zelltod herbeiführt. Hiermit konnten wir den Abbau von Zielproteinen in einen Überlebensvorteil der Zellen umwandeln. Die Zielproteine, z.B. Jak1 wurden mit der HSV-TK fusioniert. Stabile Transfektion des respektiven unbekannten Antagonisten destabilisiert das Fusionskonstrukt, führt zu der Aufhebung der TK Aktivität und erlaubt die Zellproliferation auch während der Anwesenheit von GCV, da der toxischen Wirkung von GCV entgegengewirkt wird. Es wurden Zelllinien generiert, die Fusions-Chimären von TK und Jak1 oder STAT2 stabil exprimieren. Diese Zellen waren hoch empfindlich gegenüber einer GCV-Behandlung. Das Vorgehen, den Abbau des Zielproteins in einen Überlebensvorteil umzuwandeln, wurde mittels der bekannten IFN Signalweg Inhibitoren pM27 von MCMV und dem V Protein von Parainfluenza Virus Typ 2 validiert. Der Screen wurde auf zwei verschiedene Arten angewendet: einerseits wurde eine Plasmid-basierte ORFeome Bibliothek genutzt, auf der anderen Seite eine neuartige Lentivirus-basierte HCMV cDNA Bank. Überlebende Zellklone wurden ausgewählt und angereicherte Gene in diesen Zellen mittels PCR identifiziert. Ein Genprodukt, gpUL42, reduzierte Jak1 Proteinmengen in Co-Transfektionsexperimenten. Ein HCMV Deletionsmutant, dem das respektive Gen fehlte, zeigte eine verzögerte Abbaukinetik von Jak1 im Vergleich zum Wildtyp-Virus. Dies zeigt, dass das Genprodukt gpUL42 zum Jak1 Abbau beiträgt, allerdings auch, dass noch weitere Jak1 Antagonisten von HCMV existieren müssen.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	29.04.2019
Dateien geändert am:	29.04.2019
Promotionsantrag am:	05.12.2016
Datum der Promotion:	19.10.2017