Dokument: Natural Products from Marine Sponges
| Titel: | Natural Products from Marine Sponges | |||||||
| Weiterer Titel: | Naturstoffe aus marinen Schwämmen | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=45076 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20180308-084005-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. Mokhlesi, Amin [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Proksch, Peter [Gutachter] Prof. Dr. Kalscheuer, Rainer [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | Natural Product, Marine Sponges | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Discovering the mysteries of ocean has always been a matter of human interest. The first signs of drug potential from marine resources began with the discovery of the anti-cancer nucleoside compounds from marine sponges in the mid-nineteenth century. Indeed, the pharmaceutical research of various marine organisms to date has indicated the important role of marine sponges as a prolific source of novel bioactive compounds. Moreover, due to the accessibility of humans even to the depths of the oceans, the number of bioactive compounds from marine organisms has been significantly increased. Among marine organisms, the contribution of sponges is remarkable as highlighted by the anticancer Cytosar-U® (1969), the antiviral Vira-A® (1976), and the anticancer Halaven® (2010) sponge-derived drugs, which have already reached the market.
Based on the high pharmaceutical potential of marine sponges, this study was carried out to investigate the isolation and structure elucidation of bioactive secondary metabolites from three marine sponge specimens, Lissodendoryx (Acanthodoryx) fibrosa, Clathria basilana, and Cinachyrella sp., collected in Indonesia. After sampling and transfer of these sponge specimens to laboratory, the methanol crude extract from each sponge was submitted to liquid-liquid separation to obtain MeOH, EtOAc, n-Hexan, BuOH, and water subfractions. Afterwards, the pure compounds were isolated by using different chromatographic separation techniques, such as Sephadex column (LH-20), thin layer chromatography (TLC), vacuum liquid chromatography (VLC) (R18), reversed-phase vacuum liquid chromatography (RP-VLC), analytical high pressure liquid chromatography (HPLC), and semi-preparative high pressure liquid chromatography (HPLC). The structure elucidation of the secondary substances was performed by sate of the art analytical methods, such as 1D (1H, 13C) and 2D (COSY, TOCSY, ROESY, HSQC, HMBC) nuclear magnetic resonance spectroscopy (NMR), as well as by mass spectrometry (EI, ESI, MALDI-TOF). In addition, Marfey’s analysis was used to determine the chirality of amino acids following peptide hydrolysis. In vitro cytotoxicity of the isolated compounds was measured against murine lymphoma (L5178Y), human lymphoma (Ramos), leukemia (HL-60, Nomo-1, Jurkat J16), and human ovarian carcinoma (A2780) cell lines. Moreover, the in vitro antibacterial activity of the isolated compounds was tested against different Gram-positive and Gram-negative bacteria. Finally, the cytotoxic and antibacterial mode of action for the active compounds was likewise evaluated. Overall, in this research thirty-four compounds were isolated from three sponge species, which fourteen have been identified as new natural products. In the present thesis, the results of each sponge are individually printed in the form of already published or accepted manuscripts in scientific journals: Lissodendoryx (Acanthodoryx) fibrosa Two new 2-aminoimidazole alkaloid derivatives lissodendrins A and B, have been isolated from the marine sponge, Lissodendoryx fibrosa collected in Ambon, Indonesia. Lissodendrins A and B exhibited similar molecular formula with only one oxygen difference as C17H13N3O3 and C17H13N3O4 respectively. The unusual 2D spectrum of lissodendrins and significant number of quaternary carbons was challenging for the structure elucidation of these compounds. However, the structures were unequivocally elucidated by 1H, 13C, ROESY and long-range HMBC correlations, as well by ESIMS/MS fragmentations. The skeletons of lissodendrins A and B include an unusual (p-hydroxyphenyl)glyoxal moiety, which is rarely reported in natural products. The biosynthetic pathway of lissodendrins A and B is proposed to originate from tyrosine and arginine. Clathria basilana In the second part of the thesis, the marine sponge Clathria basilana was investigated, which was collected in Indonesia. Chromatographic separation afforded six cyclic peptides, including five new compounds, microcionamides C and D, gombamides B, C, and D, along with a new derivative (E)-2-amino-3-methyl-N-styrylbutanamide. In addition, the known peptide microcionamide A, six known indole derivatives, 7-bromo- 4(1H)-quinolinone, a δ-lactam derivative (3-(2-(4-hydroxyphenyl)-2-oxoethyl)-5,6-dihydropyridin-2(1H)-one), 2-deoxythymidine, and 4-hydroxybenzoic acid, were likewise isolated. The structures of the new compounds were unambiguously elucidated based on 1D and 2D NMR spectroscopy, mass spectrometry, as well as by comparison with the literature. Subsequent Marfey’s analysis identified L-configurations for all amino acid residues of the isolated peptides (microcionamides A, C and D; gombamides B, C, and D). Moreover, HPLC resolution between L/D-Ile and L/D-allo-Ile residues was improved by using C4 HPLC RP-column instead of C18, to indicated presence of L-Ile in the isolated peptides. Moreover, in an attempt to improve the HPLC resolution between L/D-Ile and L/D-allo-Ile residues, a C4 HPLC RP-column was successfully employed, instead of the commonly used C18 column, in analogy to the C3 Marfey’s method All isolated compounds were evaluated in different bioassays. Among them, microcionamides exhibited promising anticancer and antibacterial activities. Cytotoxicity directed experiments showed IC50 values in the range from 0.45 to 5.92 µM for microcionamides A, C and D against lymphoma (Ramos), human ovarian carcinoma (A2780), and leukemia cell lines (HL-60, Nomo-1, Jurkat J16). The anticancer mechanism of microcionamides A, C, and D toward Jurkat J16 and Ramos cells indicated their ability to induce cell death via apoptosis. Microcionamides C and D were shown to block cell autophagy, which diminishes the survival of cancer cells. Moreover, microcionamides A and C inhibited Gram-positive bacteria (Staphylococcus aureus and Enterococcus faecium) with MICs from 6.25 to 12.5 µM. Interestingly, antibacterial mode of action studies indicated that microcionamides A and C are able to destruct the bacterial membrane. Cinachyrella sp. The marine sponge Cinachyrella sp., collected in Indonesia, was investigated as the last sponge species in this study. Four 2-methoxy acetylenic acids consisting of three new (cinachylenic acids B, C, and D) and the known derivative cinachylenic acid A, in addition to three new pyrazole alkaloids (cinachyrazoles A, B, and C) were isolated from the marine sponge Cinachyrella sp. One- and two-dimensional NMR spectroscopy, as well as mass spectrometry were used for the elucidation of the isolated compounds. Bioassay results showed strong cytotoxicity of all cinachylenic acids with IC50 values of 0.3 µM. Moreover, a plausible biosynthetic pathway for the cinachyrazole derivatives was proposed, originating from the linkage of an acetoacetic acid and an N-acetyl-N-methylhydrazine unit.Seit jeher steht die Erforschung der Geheimnisse des Ozeans im Interesse der Menschheit. Die ersten Anzeichen für das medizinische Potenzial von Naturstoffen aus marinen Quellen offenbarte sich in der Mitte des zwanzigsten Jahrhunderts durch die Entdeckung von antitumoralen Nukleosiden in Meeresschwämmen. Im Laufe der systematischen, pharmazeutischen Untersuchung verschiedener mariner Organismen konnte die Vorreiterroller mariner Schwämme als Quelle für neuartige bioaktive Sekundärmetabolite bestätigt werden. Durch die Erschließung der Tiefen des Ozeans durch den Menschen konnte der Schatz an bioaktiven Stoffen aus Meeresorganismen beträchtlich erweitert werden. Der von den Schwämmen zu diesem Schatz geleistete Beitrag ist bemerkenswert hoch. Dies kann durch bereits in den Arzneimittelmarkt eingeführte Medikamente wie das Krebsmedikament Cytosar-U® (1969), das Virostatikum Vira A® (1976), sowie das von Schwammmetaboliten abgeleitete Krebsmedikament Halaven® (2010), demonstriert werden. Mit dem hohen pharmazeutischen Potenzial der Meeresschwämme als Ansporn, wurden in dieser Studie bioaktive Sekundärmetaboliten aus den, in Indonesien gesammelten Schwämmen Lissodendoryx (Acanthodoryx) fibrosa, Clathria basilana und Cinachyrella sp. isoliert und deren chemische Struktur aufgeklärt. Nach der Probenentnahme und dem Transfer in das Labor wurde jeweils ein methanolischer Extrakt hergestellt, welcher durch flüssig-flüssig Verteilungschromatographie in Unterfraktionen aus Hexan, Ethylacetat, n-Butanol, Methanol und Wasser aufgeteilt wurde. Aus diesen Unterfraktionen wurden im Anschluss Reinsubstanzen isoliert. Hierbei kamen unterschiedliche chromatographische Trennverfahren zum Einsatz wie Sephadex Säulenchromatographie (LH20), Dünschichtchromatographie (TLC), Normal- und Umkehrphasen-Vakuumflüssigchromatographie (VLC/RP-VLC), sowie analytische und semipreparative Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC). Die Strukturaufklärung der isolierten Verbindungen erfolgte durch moderne eindimensionale (1H, 13C), sowie zweidimensionale (COSY, TOCSY, ROESY, HSQC und HMBC) Kernspinresonanzspektroskopie (NMR) in Kombination mit verschiedenen massenspektrometrischen Methoden (EI, ESI, MALDI-TOF). Zur Bestimmung der absoluten Konfiguration der isolierten Peptide, wurden diese hydrolisiert und die absolute Konfiguration der beteiligten Aminosäuren durch eine Marfey Analyse bestimmt. Die in vitro Zytotoxizität aller isolierten Substanzen wurde an einer Maus-Lymphomzelllinie (L5178Y), einer menschlichen Lymphomzellinie (Ramos), drei Leukämiezelllinien (HL-60, Nomo-1 und Jurkat J16), sowie einer menschlichen Ovarialkarzinomzelllinie (A2780) bestimmt. Zusätzlich wurden antibakterielle Eigenschaften in vitro sowohl gegen grampositive, als auch gramnegative Bakterien untersucht. Abschließend wurden die Verbindungen, welche sich als bioaktiv herausstellten, auf ihren antibakteriellen und zytotoxischen Wirkmechanismus hin untersucht. Zusammengefasst wurden während dieser Arbeit aus insgesamt drei Schwämmen vierunddreißig Verbindungen isoliert, von denen vierzehn als neue Naturstoffe identifiziert werden konnten. In der vorgelegten Dissertation sind die Ergebnisse zu jedem Schwamm einzeln in Form von Manuskripten abgedruckt, welche bereits in wissenschaftlichen Fachzeitschriften akzeptiert oder eingereicht worden sind. Lissodendoryx (Acanthodoryx) fibrosa Aus dem in Ambon (Indonesien) gesammelten Meeresschwamm Lissodendoryx fibrosa konnten die beiden neuen 2-Aminoimidazolalkaloide Lissodendrin A und B isoliert werden. Lissodendrin A und B unterscheiden sich nur durch ein einziges Sauerstoffatom und weisen die Molekularformeln C17H13N3O3 und C17H13N3O4 auf. Die Strukturaufklärung der Lissodendrine stellte sich aufgrund der hohen Anzahl quaternärer Kohlenstoffatome und einer ungewöhnlichen Beschaffenheit der zweidimensionalen Kernspinresonanzspektren als Herausforderung dar. Die eindeutige Bestimmung der Struktur gelang letztendlich durch den Einsatz von 1H, 13C, ROESY und long-range HMBC, sowie die Auswertung des ESIMS/MS Fragmentierungsmusters. Das Kohlenstoffgerüst von Lissodendrin A und B enthält eine ungewöhnliche (p-Hydroxyphenyl)glyoxal Einheit, welche in Naturstoffen bisher nur äußerst selten beschrieben wurde. Als Biosyntheseweg für Lissodendrin A und B wird ein Weg ausgehend von Tyrosin und Arginin postuliert. Clathria basilana Der zweite Teil der Dissertation handelt von der Untersuchung des in Indonesien gesammelten Meeresschwamms Clathria basilana. Bei der chromatographischen Aufarbeitung konnte sechs zyklische Peptide zutage gefördert werden, von denen die fünf Verbindungen Microcionamid C und D, Gombamid B, C, und D zusammen mit dem Nichtpeptid (E)-2-Amino-3-methyl-N-styrylbutanamid als neue Naturstoffe identifiziert werden konnten. Außerdem konnten das bekannte Peptid Microcionamid A, sechs bekannte Indolderivate, 7-Bromo-4(1H)-quinolinon, das δ-lactam Derivat (3-(2-(4-Hydroxyphenyl)-2-oxoethyl)-5,6-dihydropyridin-2(1H)-on), 2 Deoxythymidin und 4-Hydroxybenzoesäure isoliert werden. Die Struktur der neuen Verbindungen wurde eindeutig durch den Einsatz von ein- und zweidimensionaler Kernspinresonanzspektroskopie, Massenspektrometrie, sowie durch Vergleich mit Literaturreferenzen bestimmt. Die absolute Konfiguration der an den Peptiden beteiligten Aminosäuren konnte durch Marfey Analyse als L-Konfiguration bestimmt werden (Microcionamid C und D, Gombamid B, C, und D). Durch den ergänzenden Einsatz einer C4 Umkehrphasen HPLC konnte zudem die die Auflösung zwischen L/D-Isoleucin und L/D-allo-Isoleucin im Vergleich zu einer C18 Umkehrphase verbessert werden, wodurch die Beteiligung von L-Isoleucin in allen Peptiden nachgewiesen werden konnte. Bei Versuchen zur Auflösungsverbesserung zwischen L/D-Isoleucin und L/D-allo-Isoleucin in der HPLC-Analytik konnte die weitverbreite C18 Umkehrphase durch eine C4 Umkehrphase ersetzt werden, welche analog zur in der Marfey Analyse etablierten C3 Umkehrphase aussagenkräftige Ergebnisse erzielen konnte. Alle isolierten Verbindungen wurden unterschiedlichen Bioassays unterzogen. Hierbei lieferten vor allem die Microcionamide vielversprechende antitumorale und antibakterielleAktivitäten . Untersuchungen, die auf Zytotoxizität abzielten, lieferten für Microcionamid A, C und D zelllinienabhängige IC50-Werte zwischen 0,45 und 5,95 µM, getestet wurde gegen eine menschliche Lymphomzelllinie (Ramos), eine menschliche Ovarialkarzinomzelllinie (A2780) und Leukämiezelllinien (HL-60, Nomo-1 und Jurkat J16). Der antitumorale Mechanismus von Microcionamid A, C und D an Jurkat J16- und Ramoszellen beruht auf ihrer Fähigkeit an diesen Zellen Apoptose auszulösen. Für Microcionamid C und D konnte zudem gezeigt werden, dass diese in der Lage sind Autophagie zu inhibieren, was ein vermindertes Überleben der Krebszellen zur Folge hat. In Bezug auf die untersuchten antibakteriellen Eigenschaften zeigten Microcionamid A und C wachstumsinhibitorische Effekte auf grampositive Bakterien (Staphylococcus aureus und Enterococcus faecium) mit MIC Werten zwischen 6,25 und 12,5 µM. Interessanterweise weisen Untersuchungen am antibakteriellen Wirkmechanismus darauf hin, dass Microcionamid A und C in der Lage sind, die bakterielle Zellwand zu zerstören. Cinachyrella sp. Beim letzten in dieser Dissertation behandelten Organismus handelt es sich um den in Indonesien gesammelten Meereschwamm Cinachyrella sp.. Aus dem Schwamm konnten drei neue Pyrazolalkaloide (Cinachyrazol A, B, und C) und vier 2-Methoxy-Acetylensäuren isoliert werden. Unter den isolierten 2-Methoxy-Acetylensäuren befanden sich die bereits beschriebene Cinachylensäure A, sowie die drei neuen Naturstoffe Cinachylensäuren B, C und D. Die Strukturaufklärung erfolgte über ein- und zweidimensionale Kernspinresonanzspektroskopie, sowie den Einsatz von massenspektrometrischen Verfahren. Bioaktivitätsuntersuchungen zeigten starke zytotoxische Eigenschaften aller Cinachylensäuren mit IC50-Werten von 0,3 µM. Zusätzlich wurde für die Cinachyrazolderivate ein Biosyntheseweg postuliert, welcher von der Verknüpfung von Acetoessigsäure und einer N-Acetyl-N-Methylhydrazineinheit ausgeht. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 08.03.2018 | |||||||
| Dateien geändert am: | 08.03.2018 | |||||||
| Datum der Promotion: | 22.11.2017 |
