Dokument: Lichtregulierte Genexpression mittels photolabil geschützter Effektormoleküle in Saccharomyces cerevisiae

Titel:	Lichtregulierte Genexpression mittels photolabil geschützter Effektormoleküle in Saccharomyces cerevisiae
Weiterer Titel:	Light Regulated Gene Expression Using Photolabile Protected Effector Molecules in Saccharomyces cerevisiae
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=45075
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180720-093547-4
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kusen, Peter [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 144,83 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.03.2018 / geändert 05.03.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter] Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie
Beschreibungen:	Die Ausweitung der Forschung in den letzten Jahrzehnten zur optischen Regulation von zellulären Funktionen führte zur Etablierung der Oberbezeichnung „Optogenetik“. Diese Arbeit beschäftigt sich mit einem Teilgebiet dieser Forschung, welche auf die Regulation von genetischen Expressionssystemen zielt. Dazu wurden lichtregulierte Expressionssysteme in S. cerevisiae entwickelt, die auf dem Einsatz von photolabil geschützten Effektormolekülen, sogenannten caged compounds, beruhen. Diese photolabilen Verbindungen zerfallen bei Belichtung und setzen ein spezifisches Effektormolekül zur Regulation des jeweiligen Expressionssystems frei. Die angewendeten Expressionssysteme beruhen auf den in S. cerevisiae häufig angewendeten Promotoren pGAL1, pCUP1 und pMET17. Unter Anwendung einer caged-Cu2+ Verbindung konnte die Induktion von pCUP1-Promotor-kontrollierten Genen mittels UVA-Belichtung durch Anpassung der Belichtungszeit graduell reguliert werden. Auf diesem Wege konnte der Einfluss des Induktionszeitpunktes auf die Expression von pCUP1-kontrollierten Genen charakterisiert werden. Die lichtregulierte Genexpression zeichnete sich dabei durch eine nichtinvasive Freisetzung des Effektors aus, wodurch eine Aufrechterhaltung der Sterilbarriere, gleichbleibende atmosphärische Bedingungen, ein konstanter Gastransfer und eine Minimierung von Verdunstung und Verdünnung gewährleistet werden konnte. Darüber hinaus wurde die optische Repression von pMET17-Promotor-kontrollierten Genen durch Einsatz einer caged-Methionin Verbindung demonstriert. Komplexe Schaltungen bis hin zu einer automatisierten Belichtungsregulation wurden durch die Kombination von optischer Methionin-Freisetzung und zellulären Methionin-Abbau erzeugt. Sie ermöglichten die optische Regulation von Expressions-Start, -Stopp, -Pause und -Rate. Dabei konnte eine hohe Regulationsfrequenz, eine gute Dosierbarkeit der Effektor-Freisetzung sowie eine leichte Automatisierbarkeit unter Reduzierung des mechanischen Aufwandes demonstriert werden. Des Weiteren konnten Vorarbeiten zur lichtregulierten Induktion des pGAL1- und zur Repression des pCUP1-Promotors durchgeführt werden. Hierzu wurden die entsprechenden Reporterstämme charakterisiert und erste caged-Galaktose und caged-EDTA Verbindungen getestet. Dabei konnten die photolytische Zerfallsgeschwindigkeit von caged-Galaktose bzw. die Maskierung der Cu2+-Affinität von caged-EDTA als limitierende Faktoren und somit als Ansatzpunkte für weiterführende Arbeiten identifiziert werden. In recent decades, the optical regulation of cellular functions has become a fast developing field of research. This led to the establishment of "Optogenetic" as generic term. One part of this research field is the regulation of genetic expression systems. In this thesis, light-regulated expression systems in S. cerevisiae have been developed, which are based on the use of photolabile protected effector molecules, so-called caged compounds. These photolabile compounds release upon illumination a specific effector molecule that regulates a respective expression system. The expression systems applied were based on the pGAL1, pCUP1 and pMET17 promoters commonly used in S. cerevisiae. By means of a caged-Cu2+ compound, the induction of pCUP1-promoter-controlled genes could be gradually regulated by adjusting the UVA exposure time. In this way, the influence of the induction time on the expression of pCUP1-controlled genes could be studied. Thereby, light-regulated gene expression was characterized by a non-invasive release of the effector, which ensured permanent sterility, constant atmospheric conditions, constant gas transfer and a minimization of evaporation and dilution. In addition, the optical repression of pMET17 promoter-controlled genes was demonstrated by using a caged-methionine compound. Complex circuits up to automated exposure regulation were generated by the combination of optical methionine release and cellular methionine degradation. They enabled the optical regulation of expression start, stop, pause, and rate. Thus, a high regulation frequency, a good dosage of the effector release as well as an easy automation and a reduction of the mechanical effort could be demonstrated. Furthermore, preliminary studies were carried out on the induction of the pGAL1 and on the repression of the pCUP1 promoter via light-regulation. For this purpose, the corresponding reporter strains were characterized and first caged-galactose and caged-EDTA compounds were tested. The photolytic decay rate of caged-galactose and the masking of the Cu2+ affinity of caged-EDTA were identified as limiting factors and thus as starting points for further work.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Chemie » Bioorganische Chemie
Dokument erstellt am:	20.07.2018
Dateien geändert am:	20.07.2018
Promotionsantrag am:	05.01.2018
Datum der Promotion:	16.02.2018