Dokument: Eignung rekombinant hergestellter T. gondii- Proteine zur serologischen Diagnose einer Toxoplasmose

Titel:	Eignung rekombinant hergestellter T. gondii- Proteine zur serologischen Diagnose einer Toxoplasmose
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44987
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180227-102836-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Minkus, Stefanie [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,73 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 23.02.2018 / geändert 23.02.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Däubener, Walter [Betreuer/Doktorvater] PD Sixt, Stephan Urs [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	The parasite toxoplasma gondii (t. gondii) is a pathogenic organism that causes toxoplasmosis and propagates obligatory intracellular. It can attack all core-holding cells of endotherms, as well as thus of human beings. After invasion of the host cell GRA- proteins are secreted from the “dense granules” during the whole development of t. gondii, therefore they can be continuously recognized by the immune system. The primary focus of the presented dissertation was the production of recombinant GRA-proteins (rGRA1, rGRA2, rGRA6, rGRA7, rGRA9 and rMIC5) and their use in western blot analysis. Therefore cDNA-constructs, that encode for corresponding proteins, were inserted in an E.coli-expression vector pET32a(+). After successful ligation of the constructs pET32a(+)-GRA1-His, pET32a(+)-GRA2-His, pET32a(+)-GRA6-His, pET32a(+)-GRA7-His, pET32a(+)-GRA9-His, as well as pET32a(+)-MIC5-His they were transformed into E.coli DH5α and scratched out on ampicillin agar plates. The growing clones were verified using sequence analysis and restriction enzymes and were subsequently transformed into the E.coli- transformation strain BL21(DE3). Next the denaturating protein purification using affinity chromatography was done and consecutively evaluated via SDS-gel electrophoresis. Susequently these recombinant antigens were used in western blots to analyse their potential to be used in the diagnosis of toxoplasmosis. In summary, t. gondii-specific IgG-antibodies were found in sera of patients suffering from acute or reactivated toxoplasmosis (n=35) against rGRA2(96%), rGRA6(96%) and rGRA7(88%). With regard to the IgM-detection, there could be found IgM-antibodies in all sera of patients with an acute or reactivated infection (n=14) (rGRA2(61%), rGRA6(92%) rGRA7(67%)) In the presented doctoral thesis specific IgA-antibodies exhibited less frequent detection, and were directed against rGRA2(46%), rGRA6 (44%) and rGRA7 (36%). Considering sera of humans chronically infected with t. gondii 91% IgG-antibodies were found against rGRA2 as well as rGRA6 and 73% against rGRA7 and rGRA9. The presented doctoral thesis clarifies, that the t. gondii- proteins used in this dissertation are suited for the diagnosis of toxoplasmosis. Following trials should review, if a combination of these antigens for example using a line-blot could be established in the routine clinical diagnostics Der Parasit Toxoplasma gondii (T. gondii) ist der Krankheitserreger der Toxoplasmose und vermehrt sich obligat intrazellulär. Er kann alle kernhaltigen Zellen von Warmblütern, also auch des Menschen, befallen. Da nach Invasion der Wirtszelle während des kompletten Entwicklungszyklus von T. gondii GRA-Proteine aus den „dense granules“ des Parasiten sezerniert werden, können diese kontinuierlich vom Immunsystem erkannt werden. Der primäre Fokus der vorliegenden Arbeit lag somit in der Synthese rekombinanter GRA-Proteine (rGRA1, rGRA2, rGRA6, rGRA7, rGRA9 und rMIC5) zur Verwendung in Western Blot-Analysen. Hierfür wurden cDNA-Konstrukte, die für die entsprechenden Proteine kodieren, in einen E. coli- Expressionsvektor pET32a(+) eingefügt. Nach erfolgreicher Ligation der Konstrukte pET32a(+)-GRA1-His, pET32a(+)-GRA2-His, pET32a(+)-GRA6-His, pET32a(+)-GRA7-His, pET32a(+)-GRA9-His, sowie pET32a(+)-MIC5-His wurden diese in E. coli DH5α transformiert und anschließend auf Ampicillinplatten ausgestrichen. Die anwachsenden Klone wurden mittels Sequenzanalyse und Restriktionsverdau überprüft und anschließend in den E. coli- Expressionsstamm BL21(DE3) transformiert. Es folgte die denaturierende Proteinaufreinigung mittels Affinitätschromatographie und anschließend deren Kontrolle via SDS-Gelelektrophorese. Nachfolgend wurde in Western Blot-Analysen überprüft, ob diese rekombinanten Antigene zur Diagnose einer Toxoplasmose geeignet sind. Zusammenfassend konnten in Seren von Patienten mit akuter oder reaktivierter Toxoplasmose (n= 35) T. gondii-spezifische IgG-Antikörper gegen rGRA2(96%), rGRA6(96%) und rGRA7(88%) gefunden werden. In allen Seren von Patienten mit einer akuten oder reaktivierten Infektion (n=14) konnten spezifische IgM-Antikörper nachgewiesen werden (rGRA2(61%), rGRA6(92%) rGRA7(67%)). Spezifische IgA-Antikörper konnten in der hier vorliegenden Arbeit seltener detektiert werden (n=14) und waren gegen rGRA2(46%), rGRA6 (44%) und rGRA7 (36%) gerichtet. In Seren von chronisch mit T. gondii- Infizierten konnten in 91% IgG-Antikörper gegen rGRA2 sowie rGRA6 und in 73% gegen rGRA7 und rGRA9 gefunden werden. Die hier vorliegende Arbeit verdeutlicht, dass die in der Arbeit analysierten T. gondii-Proteine zur Diagnose einer Toxoplasmose geeignet sind. In zukünftigen Experimenten soll überprüft werden, ob eine Kombination dieser Antigene beispielsweise im Line-Blot-Verfahren in der Routinediagnostik eingesetzt werden kann
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Medizinische Mikrobiologie
Dokument erstellt am:	27.02.2018
Dateien geändert am:	27.02.2018
Promotionsantrag am:	09.08.2017
Datum der Promotion:	22.02.2018