Dokument: Etablierung eines standardisierten in vitro Modellsystems zur Vaskularisierung azellulärer kardialer extrazellulärer Matrix: Das Coronary Artery Tissue-Flap Model

Titel:	Etablierung eines standardisierten in vitro Modellsystems zur Vaskularisierung azellulärer kardialer extrazellulärer Matrix: Das Coronary Artery Tissue-Flap Model
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44966
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180221-100519-8
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kranz, Alexander [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 12,44 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 20.02.2018 / geändert 20.02.2018
Beitragende:	PD Dr. med. Aubin, Hug [Betreuer/Doktorvater] Prof. Dr. Lichtenberg, Artur [Gutachter] PD Dr. med. Simon, Florian [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Zusammenfassung Trotz beachtlicher Fortschritte auf dem Gebiet des myokardialen Tissue Engineerings stellt die funktionelle Vaskularisierung eines bioartifiziellen Herzmuskelgewebes auch heute noch eine große Herausforderung dar. Ziel dieser Arbeit war es daher, ein biologisches, kardiales in vitro Modellsystem zu entwickeln, mit dessen Hilfe es möglich ist, neue Strategien zur Vaskularisierung tissue engineerten Myokards zu evaluieren. Dafür wurden Rattenherzen mittels eines softwaregesteuerten Langzeit- Perfusionssystems standardisiert dezellularisiert. Das Gefäßsystem der azel- lulären Herzen wurde anschließend mithilfe verschiedener perfusionsbasierter sowie histologischer Verfahren untersucht. Durch retrograde Perfusion der Aorta ascendens konnten sowohl nicht-endotheliale Zellen als auch humane Nabelschnurendothelzellen im Koronarsystem der dezellularisierten Rattenherzen angesiedelt und kultiviert werden. Einem mikrochirurgischen Präparations- verfahren folgend wurden die rebesiedelten Organe zu einem kardialen Matrixmodell weiterverarbeitet. Rebesiedlungs-Effektivität, Vitalität und metabolische Aktivität der intrakoronar kultivierten Zellen konnten mithilfe verschiedener Vitalitäts- und eines Stoffwechsel-Assays quantitativ und qualitativ analysiert werden. Im Zuge der Etablierung einer kontrollierten Kokultur erfolgte zudem die Besiedlung einer zuvor re-endothelialisierten EZM mit neonatalen Rattenkardiomyozyten. Mittels selektiver Koronarostien-Kanülierung und Perfusion mit humanem Vollblut konnte die Hämokompatibilität azellulärer und rebesiedelter Gefäße analysiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte eine große Anzahl Rattenherzen in toto standardisiert dezellularisiert werden. Die Integrität des koronaren Gefäßsystems sowie wichtige makro- und mikroskopische Charakteristika der Organanatomie konnten dabei erhalten werden. Darüber hinaus war es möglich, den de- endothelialisierten Gefäßbaum der zellfreien Organgerüste einer umfassenden und hochselektiven Rebesiedlung zu unterziehen. Durch mikrochirurgische Präparation der re-endothelialisierten Organe sowie durch zusätzliche Besiedlung extravasaler EZM-Kompartimente mit kardialen Zellen konnte schließlich ein biologisches, vaskularisiertes, kardiales in vitro Modellsystem, das Coronary Artery Tissue-Flap Model (CATFM), geschaffen werden. Auch nach erfolgreicher Rebesiedlung blieben die Integrität der Gefäß-EZM sowie deren Durchgängigkeit für Vollblutkomponenten bis hin zum Kapillarbett vollständig erhalten. Das hier entwickelte CATFM bietet die Möglichkeit, Re-Endothelialisierungs- Kapazität, Endothelfunktion sowie zelluläre Interaktion in einem standardisierten, biologischen, kardialen in vitro Modellsystem zu untersuchen. Zusätzlich zur Evaluation von Strategien zur funktionellen Vaskularisierung bioartifizieller Gewebe könnte das CATFM künftig auch als Testsystem für pharmakologische Studien und Analysen zur Stammzelldifferenzierung weitere Anwendungsbereiche erschließen. Abstract Despite remarkable progress in the field of tissue engineering and regenerative medicine the vascularization of a three dimensional bioartificial myocardium still remains a major challenge. Hence, it was the object of the present study to establish a standardized biologically derived cardiac in vitro model that allows us to develop new strategies to create a functional vascularized myocardium. Therefore in this study rat hearts were decellularized in toto by standardized coronary perfusion through automated software-controlled retrograde aortic perfusion. Protein diffusivity analysis, blood perfusion of the coronary arteries as well as different histological analyses were used to asses the coronary artery vessel system after decellularization. Through selective coronary perfusion via retrograde aortic perfusion the coronary vessel system of the in toto decellularized rat hearts was seeded with different cell types (standard murine fibroblast cell line and human umbilical vein ECs). A standardized coronary artery tissue-flap model (CATFM) was created by microsurgical dissection of the decellularized and subsequently reseeded whole hearts into two tissue flaps adherent to the ascending aorta and encasing the left and right coronary artery, respectively. Seeding efficacy, cell viability and metabolic activity were analyzed by assessing the intracellular esterase activity and plasma/nuclear membrane integrity as well as the cellular low density lipoprotein uptake. For controlled coculture with primary cardiac cells the re-endothelialized extracellular matrix was surface seeded with cardiac cells from neonatal rat hearts. For evaluation of vessel patency and sealing for cellular blood components before and after recellularization, coronary ostia of the above-mentioned tissue flaps were selectively catheterized and perfused with citrated whole blood. In this study a large number of rat hearts were successfully decellularized in toto by means of a highly standardized dezellularization process, conserving the patency and integrity of the de-endothelialized coronary artery vessel system including crucial ECM characteristics. Retrograde aortic perfusion allowed for selective seeding of the coronary artery system. Microsurgical dissection of the re- cellularized whole hearts and subsequent surface seeding of the tissue flaps enabled additional controlled coculture with cardiac cells. In all repopulated tissue flaps, the catheterized part of the coronary artery system was still patent, demonstrated by blood perfusion that revealed repopulated vessels to ensure perfusibility of cellular blood components even down to capillary-like structures. The coronary artery tissue-flap model offers a patent and perfusable coronary vascular architecture with a preserved cardiac extracellular matrix, therefore mimicking nature’s input to the highest possible degree. This offers the possibility to study re-endothelialization and endothelial function of different donor cell types and their inter- action with cardiac cells in a standardized biologically derived cardiac in vitro model, while establishing a real-cardiac-like test system for in vitro drug testing and stem cell differentiation studies.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	21.02.2018
Dateien geändert am:	21.02.2018
Promotionsantrag am:	07.04.2017
Datum der Promotion:	06.02.2018