Dokument: Untersuchungen zur Metabolisierung therapeutisch aktiver D-Peptide
| Titel: | Untersuchungen zur Metabolisierung therapeutisch aktiver D-Peptide | |||||||
| Weiterer Titel: | Investigations on the metabolization of therapeutically active D-peptides | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44940 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20190222-092408-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Elfgen, Anne [Autor] | |||||||
| Dateien: |
| |||||||
| Beitragende: | Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. Heise, Henrike [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Die Alzheimer-Demenz (AD) ist eine neurodegenerative Erkrankung und die häufigste Form der Demenz. Die Zahl der an AD erkrankten Menschen wird aktuell weltweit auf mehr als 20 Millionen geschätzt. Da derzeit lediglich palliativ wirkende Medikamente zugelassen sind, die die Progression der Krankheit aber nur kurzzeitig verlangsamen können, ist die Nachfrage nach krankheitsmodulierenden und kausalen Therapieansätzen sehr hoch. Für die Entstehung und Progression der Krankheit wird nach vorherrschender Meinung das Amyloid-β-Peptid (Aβ) verantwortlich gemacht, dessen nicht-toxische Monomere zu neurotoxischen Oligomeren aggregieren können, die letztendlich zur Neurodegeneration führen. Ein vielversprechender Therapieansatz ist daher die Stabilisierung der Aβ-Monomere und die gezielte Eliminierung bereits bestehender Aβ-Oligomere. Auf dieser Strategie basiert der Wirkmechanismus des D-enantiomeren Peptids D3, das mittels Spiegelbild-Phagendisplay gegen Aβ-Monomere selektiert wurde. Die Wirksamkeit von D3 konnte bereits in vitro und in vivo bestätigt werden. Durch rationale Umstrukturierung dieser Leitstruktur wurde das D-Peptid RD2 entwickelt, das in vitro eine verbesserte Interaktion mit Aβ im Vergleich zu D3 zeigte und in vivo kognitive Defizite transgener AD-Mäuse verbesserte. Für die in vitro-Charakterisierung wurde u.a. ein Nukleationsassay zur Untersuchung des Einflusses von RD2 auf die Nukleus-induzierte, beschleunigte Aggregation entwickelt. Es zeigte sich, dass RD2 den katalytischen Effekt der Aβ-Nuklei auf die Aβ-Aggregation signifikant verringert.
Sollen diese Wirkstoffe oral appliziert werden, muss sichergestellt werden, dass sie eine hohe Resistenz gegenüber metabolischen Prozessen aufweisen. Für D3 und RD2 konnte gezeigt werden, dass sie aufgrund ihrer D-enantiomeren Struktur einen entscheidenden Vorteil gegenüber häufig verwendeten L-Peptiden bieten: Sie wiesen eine außerordentlich hohe Stabilität gegenüber Proteasen und CYP-Enzymen auf, die im Gastrointestinaltrakt, im Blut und in der Leber u.a. für die Wirkstoff-Metabolisierung verantwortlich sind. Obwohl bei der Leberpassage viele Wirkstoffe für eine Begünstigung des Abbaus und der Ausschleusung modifiziert werden, wurden bei RD2 nur wenige Metaboliten in vitro in Lebermikrosomen gebildet. Der am häufigsten gebildete Metabolit wurde identifiziert und stellte sich als nicht toxisches und reversibles Produkt Formaldehyd-kontaminierter Lebermikrosomen heraus. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass RD2 kein Substrat für die humane D-Aminosäureoxidase (DAAO) darstellt, obwohl diese auf die Metabolisierung D-enantiomerer Aminosäurereste spezialisiert ist. RD2 nahm außerdem keinen Einfluss auf die Aktivität der DAAO und der Enzyme, die an der Peptid-Metabolisierung in den zuvor genannten Medien beteiligt sind. Zur Verbesserung der oralen Bioverfügbarkeit von RD2 wurden zwei Folsäure-RD2-Konjugate entwickelt, durch die die RD2-Aufnahme über das Darmepithel begünstigt werden soll. Die Metabolisierung zum unkonjugierten Wirkstoff RD2 wurde in vitro und in vivo untersucht. Eines der beiden Folsäure-RD2-Konjugate stellte sich dabei als potentiell geeignetes Prodrug heraus, das bei oraler Applikation im Gastrointestinaltrakt voraussichtlich stabil bleiben und erst nach systemischer Aufnahme im Blut und in der Leber gespalten werden wird. Des Weiteren wurde eine sensitive und schnelle bioanalytische Methode entwickelt und validiert, um unmarkiertes RD2 in Maus-Plasma zu quantifizieren. Die Herausforderungen bestanden u.a. darin, eine geeignete Extraktionsmethode und ein chromatographisches Trennverfahren mit Massenspektrometrie-Kopplung für das äußerst hydrophile Peptid zu entwickeln. Mithilfe der validierten Methode wurden Plasmaproben RD2- und Placebo-behandelter Mäuse analysiert.Alzheimer’s disease (AD) is a neurodegenerative disorder and the most common form of dementia. The number of people with AD is currently estimated at more than 20 million worldwide. Since only palliative drugs, which can only slow down the progression of the disease temporarily, have been approved so far, the demand for disease modulating and causal therapeutic approaches is very high. The development and progression of the disease is commonly believed to be caused by the amyloid-β peptide (Aβ), whose non-toxic monomers can aggregate into neurotoxic oligomers that ultimately lead to neurodegeneration. Hence, a promising therapeutic approach is the stabilization of Aβ monomers and the targeted elimination of existing Aβ oligomers. The mechanism of action of the D-enantiomeric peptide D3, which was selected by means of mirror image phage display against Aβ monomers, is based on this strategy. The efficacy of D3 has already been confirmed in vitro and in vivo. By rational rearrangement of this lead compound, the D-peptide RD2 has been developed, which showed a superior interaction with Aβ in vitro compared to D3 and improved cognitive deficits of transgenic AD mice in vivo. Amongst others, a nucleation assay to investigate the influence of RD2 on nucleus-induced, accelerated aggregation was developed for in vitro characterization. It was shown that RD2 significantly reduces the catalytic effect of Aβ nuclei on Aβ aggregation. To orally administer these drugs, it must be ensured that they have a high resistance against metabolic processes. D3 and RD2 have been shown to offer a decisive advantage over commonly used L-peptides due to their D-enantiomeric structure: They exhibited an extremely high stability towards proteases and CYP enzymes, which are, amongst others, responsible for drug metabolization in the gastrointestinal tract, the blood and the liver. Although many drugs are modified during liver passage to facilitate degradation and clearance, only a few RD2 metabolites were generated in vitro in liver microsomes. The most abundant RD2 metabolite was identified and found to be a non-toxic and reversible product of formaldehyde-contaminated liver microsomes. Additionally, it was shown that RD2 is not a substrate for the human D-amino acid oxidase (DAAO) although it is specialized in metabolizing D-enantiomeric amino acid residues. Moreover, RD2 did not have any effect on the activity of the DAAO and the enzymes involved in peptide metabolization in the aforementioned media. For improved oral bioavailability of RD2, two folic acid-RD2-conjugates were developed to promote RD2 uptake across the intestinal epithelium. The metabolization to the unconjugated drug RD2 was investigated in vitro as well as in vivo. One of the two folic acid-RD2-conjugates was found to be a potentially suitable prodrug that is expected to remain stable in the gastrointestinal tract and to be cleaved in the blood and the liver after systemic uptake when administered orally. Furthermore, a sensitive and rapid bioanalytical method was developed and validated in order to quantify unlabeled RD2 in mouse plasma. The main challenges were to develop a suitable extraction method and a chromatographic separation method with mass spectrometry coupling for the highly hydrophilic peptide. Using the validated method, plasma samples of RD2 and placebo treated mice were analyzed. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 22.02.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 22.02.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 06.12.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 16.01.2018 |
