Dokument: Nicht-enzymatische Kupfer-Albumin induzierte NO-Freisetzung in vitro

Titel:	Nicht-enzymatische Kupfer-Albumin induzierte NO-Freisetzung in vitro
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44882
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180216-100820-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Brodski, Alexander [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 2,68 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 09.02.2018 / geändert 09.02.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Suschek, Christoph V. [Gutachter] Heiß, Christian [Gutachter]
Stichwörter:	Stickstoffmonoxid, NO, Kupfer, Nitrit, Nitritreduktase
Dewey Dezimal-Klassifikation:	600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit
Beschreibungen:	Während einer Ischämie kann anorganisches Nitrit durch Reaktion mit Hämtragenden Proteinen oder Thiolgruppen-tragenden Enzymen zu NO reduziert werden. NO ist ein bekannter Regulator der Vasodilatation sowie ein protektives Molekül gegen oxidativen Stress-induzierte Gewebsschäden. Ein wichtiger Vorgang des Ischämie-induzierten oxidativen Stresses, Hypoxie und Azidose ist die Dissoziation von proteingebundenen Metallen, wie des Fe2+ oder Cu2+. In Anwesenheit geeigneter körpereigener Antioxidantien bzw. Reduktionsmittel könnte hierbei insbesondere die Reduktion von Cu2+ zu Cu1+ ein bis dato noch nicht untersuchten Cu1+-abhängigen Mechanismus der nicht-enzymatischen NO-Generierung durch Reduktion von Nitrit darstellen. Im Rahmen der hier vorgelegten Arbeit sollte der Mechanismus der Kupfer-Dissoziation von Albumin-Kupfer-Komplexen unter ischämischen Bedingungen in vitro evaluiert werden, sowie die nitrit-reduzierende Kapazität von Antioxidantien und bivalentem freien Kupfer charakterisiert werden. Des Weiteren sollte die Hypothese überprüft werden, dass Albumin aufgrund seiner Fähigkeit, Kupfer zu binden, sowie der Präsenz einer stark reduzierenden Thiolgruppe, über eine Cu1+-mediierte Nitritreduktase-Aktivität verfügt. Es konnte gezeigt werden, dass unter Ischämie-charakteristischen Bedingungen, wie erniedrigtem pH und oxidativem Stress, die Kupferbindungskapazität vom Serumalbumin stark abnimmt und in einer signifikanten Dissoziation von Kupfer in die Lösung resultiert. Während der Verlust der Kupferbindungskapazität im Fall eines erniedrigten pH nahezu vollständig reversibel war, führte oxidativer Stress zu einem irreversiblen Verlust der Kupferbindungsfähigkeit des Albumins. In Anwesenheit von physiologisch-relevanten Antioxidantien wie Ascorbat oder Glutathion wurde das nunmehr proteinungebundene, freie Cu2+ zu Cu1+ reduziert, welches als ein starker Reduktor des Nitrits zu einer starken und signifikanten nicht-enzymatischen Generierung von NO führte. Ein besonders wichtiges Ergebnis war zudem der Befund, dass unter physiologischen sowie pathophysiologischen Bedingungen Albumin selbst eine Nitritreduktase-Aktivität ausübt. Diese ist im wesentlichen Maße abhängig von der Präsenz einer reduzierten Thiolgruppe des Proteins, sowie der Bindung von Kupfer an seine spezifische Kupferbindungsstelle. Interessanterweise kann die Nitritreduktaseaktivität des Albumins durch Beladung des Moleküls mit exogen zugesetztem Cu2+ und gleichzeitiger Exposition mit Antioxidantien zusätzlich signifikant erhöht werden. Die hier vorgestellten Daten zeigen erstmals, dass unter schämischen Bedingungen Kupfer-tragende Proteine ihre Bindungsfähigkeit zu diesem Metall verlieren können und dass das resultierende freie Cu2+ in Anwesenheit von Antioxidantien ein Nitrit-reduzierendes Prinzip der biologisch relevanten nicht-enzymatischen NO-Generierung darstellen kann. Weiterhin können hier erstmals Hinweise darauf gegeben werden, dass Albumin über eine Kupfer-mediierte Nitritreduktaseaktivität verfügt und analog zu Hämproteinen einen physiologisch relevanten NO-abhängigen Schutzmechanismus gegen Ischämie-indizierte Schäden darstellen könnte. During ischemia, inorganic nitrite can be reduced by hemeproteins or thiol- containing enzymes to form nitric oxide (NO). NO is a known modulator of vasodilatation and displays protective properties against oxidative stress related tissue damage. The dissociation of protein bound metals such as Fe2+ and Cu2+ is a crucial process during ischemia induced oxidative stress, hypoxia and acidosis. In presence of intrinsic antioxidants, Cu2+ can be reduced to Cu1+. Under these circumstances, this process could represent a novel, Cu1+-dependent mechanism of non-enzymatic nitrite reduction leading to significant NO formation. This dissertation studied mechanisms of copper dissociation from copper- albumin-complexes under ischemic conditions in vitro. The nitrite-reducing capacity of antioxidants and divalent copper was also investigated. Furthermore, albumin’s capacity to act as a nitrite reductase secondary to its copper-binding ability as well as its potent thiol group, was evaluated. It was demonstrated, that under ischemic conditions such as acidic pH and oxidative stress, albumin’s ability to bind copper declined significantly with consequent formation of free copper ions. While acidosis-induced decline was reversible, oxidative stress lead to a permanent loss of albumin’s copper binding capability. In presence of physiological antioxidants (such as ascorbate and glutathione), free Cu2+ was reduced to Cu1+, which itself demonstrated potent nitrite reducing properties. An important finding was the identification of albumin as a nitrite reductase under physiological and pathological conditions. Proposed mechanisms of this finding rely on the reducing capacity of albumin’s thiol group as well as copper binding to its specific site. Interestingly, the nitrite reducing capacity was increased when albumin was loaded with exogenous copper and when additional antioxidants were provided. The demonstrated data show for the first time, that copper-containing proteins lose their ability to bind copper if subjected to ischemic conditions. In presence of antioxidants, the dissociated Cu2+-ions can reduce nitrite to form NO. Moreover, this novel research indicates that in analogy to hemeproteins, albumin exhibits a copper-mediated nitrite-reductase-activity leading to a NO-dependent protection against ischemia induced damage.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät
Dokument erstellt am:	16.02.2018
Dateien geändert am:	16.02.2018
Promotionsantrag am:	01.06.2017
Datum der Promotion:	06.02.2018