Dokument: Upstream Approaches for Whole Heart Tissue Engineering

Titel:	Upstream Approaches for Whole Heart Tissue Engineering
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44842
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180215-144517-0
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Hülsmann, Jörn [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 24,22 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 07.02.2018 / geändert 07.02.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Lichtenberg, Artur [Gutachter] Prof. Dr. Lammert, Eckhard [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Erkrankungen des Herzens sind mit einem Anteil von mehr als 20 % für einen Großteil der Todesfälle in Europa verantwortlich [1]. Eine echte Heilung übersteigt bis heute leider noch die medizinischen Therapiemöglichkeiten. Allerdings gab es in der jüngsten Vergangenheit einen hoffnungsschöpfenden Durchbruch in der Kardiovaskulären Forschung indem der Ansatz des sog. Whole Heart Tissue Engineerings die komplexe Mikroarchitektur der Extrazellulärmatrix des Myokards dem mittlerweile sehr fortgeschrittenen Forschungsgebiet kardialer regenerativer Medizin eröffnete [2-4]. Diese Arbeit konzentriert sich auf Grundanforderungen für eine angestrebte pharma-industrielle Produktion von Ganzherz-Konstrukten als Medizinprodukt und soll dafür Lö-sungsansätze auf dem Stand des wissenschaftlichen Fortschritts bereitstellen. In aktuellen Studien liefern die gängigen Methoden zur Herstellung und Prozessierung von Ganzherz-Konstrukten bereits vielversprechende Ergebnisse [5-9]. Allerdings scheint die Entwicklung hier im Grundkonsens einer Ein-Schritt-Gesamtoptimierung zu folgen. Dabei werden sowohl Donororgane als auch Zellen von möglichst klinischer Relevanz verwendet, um maximale Zellzahlen so lange wie technisch möglich unter Einsatz bewährter biophysikalischer Stimu-lation zu kultivieren. Im direkten Gegensatz dazu ist es die zentrale Arbeitshypothese dieser Arbeit, dass weder der gegebene wissenschaftliche Fortschritt noch der Stand der Technik dem hohen wissenschaftlichen Anspruch dieser Vorgehensweise bereits entspricht. Bei der Bearbeitung dieser Arbeitshypothese musste zunächst der bisher undurchsichtige Prozess der Zellentfernung, die Dezellularisierung, aufgeklärt und verfahrenstechnisch greif-bar gemacht werden. Dafür wurde die Dynamik und Kinetik des Biomasseaustrags ermittelt und mit Hilfe von Parametern und Variablen beschrieben. Über den Vergleich spezifischer Austragsraten zeigte sich, dass die Größe und Masse eines Organs offenbar weniger Einfluss auf die Dynamik der Dezellularisierung hat, sondern es vielmehr eine beachtliche individuelle Varianz zwischen einzelnen Organen vergleichbarer Biomasse gibt. Über Compu-tersimulationen auf Basis eines vereinfachten Austragsmodels konnten diese Varianzen hauptsächlich auf Massentransportlimitierungen zurückgeführt werden. Während der Perfu-sions-Dezellularisierung zeigten sich charakteristische fluiddynamische Phänomene, die on-line identifiziert und bioanalytisch dem Auftreten von Viskoelastizität basierend auf der Frei-setzung von Zelldebris in das Perfusat zugeordnet werden konnten. Damit gibt es nun eine realistische Messgröße als Grundlage für zukünftige Prozessautomatisierung und Qualitäts-kontrolle. Weiterhin wurden die etablierten Verfahren von biomechanischer und elektrophy-siologischer Stimulation auf die Kultivierung von Ganzherz-Konstrukten übertragen und in “proof of principle“ Studien etabliert. Unter Dehnung des linken Ventrikels zeigte sich dabei in kurzen kontrollbasierten Modell-Kultivierungen eine deutliche Steigerung in der räumlichen Organisation und metabolischen Aktivität sowie in der Entwicklung von zellbiologischen Grundbausteinen myokardialer Funktionalität wie Myosin und Connexin 43 in neonatalen Kardiomyozyten. Zusätzlich zeigte die Stimulation über ein achtpoliges elektrisches Feld eine deutliche gesteigerte Intensität von Amplituden und Schlagraten gemessener spontaner elektrophysiologischer Aktivität sowie ebenso gesteigerte Anteile der myokardialen Markerproteine Myosin, Troponin T, Desmin und Connexin 43. Die Erkenntnisse aus diesen Studien liefern somit eine solide Basis und wichtige Ansatzpunkte für zukünftige Optimierungsprozesse. Cardiac diseases and subsequent injury to the heart belong to the major causes of mortality in the EU with a quota of more than 20 % [1]. Up to now, in many circumstances truly curative treatment options remain beyond of our abilities. But in the recent past, the approach of whole heart tissue engineering has raised hope by providing access to the complex architecture of native myocardial extracellular matrix for the by now very advanced and sophisticated field of myocardial regenerative medicine [2-4]. This work focuses on interface and transfer problems between scientific advance in whole heart tissue engineering and basic requirements for a potential pharmaco-industrial production of whole heart constructs (WHC) as medical devices. While current studies on the generation and processing WHC have already reported promising results, the consensus seems to aspire to one step optimization by trial and error [5-9]. Thereby preferably human sized scaffolds are repopulated preferably with cells of a prospective clinical relevance at maximal cell-densities and processed as long as technically possible under biophysical stimulation, which again is mostly designed as advanced as possible. In contrast, the central working hypothesis of this work is that neither the scientific advance and state of knowledge, nor the scientific-technical state of the art already complies with the demands of that high scientific level. From the perspective of a procedural upstream, at first the black-box process of cell removal by decellularization had to be enlightened. For the first time, we resolved the dynamics and kinetics of biomass depletion and determined parameters and variables that enabled us to describe the decellularization as a decomposition process. Thereby discovered characteristics imply a certain independency from the biomass amount, but rather an increased susceptibility for individual organs with regards to mass transport limitations. Moreover we identified characteristic fluid dynamical phenomena and evaluated the underlying development of vis-coelasticity in the perfusates as a quantitative measure for the release of cell-debris during perfusion based whole heart decellularization. Furthermore we designed an open and integrative bioreactor system that transfers key prin-ciples of biophysical stimulation, that have been established in the field of myocardial tissue engineering, to the whole heart approach. By our concept of fully automated and controlled left ventricular stretching we found a clearly beneficial impact on cellular spatial alignment, metabolic activity and the development of myocardial functionality by increasing the specific contents of myosin heavychain and connexin 43 in control based short term model cultiva-tions (CMC) with neonatal rodent cardiomyocytes. Moreover we adapted the concept of elec-trical field stimulation to the spatially highly organized WHC by an alternating 8-pole setting. Its application in the herein established CMC method could provoke significantly increased functional electrophysiological activity as measured by amplitudes in surface voltage record-ings and as indicated by the rate of spontaneous beating activity. These findings could further be substantiated by western blot analyses showing increased ratios of myosin heavychain, cardiac troponin T, desmin and connexin 43. Overall this work presents first cornerstones for a non-destructive monitoring and quality control of the decellularization process on the one hand and for further process optimization on the subsequent procedural flow of WHC generation and processing.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	15.02.2018
Dateien geändert am:	15.02.2018
Promotionsantrag am:	11.10.2017
Datum der Promotion:	26.02.2018