Dokument: Untersuchung und Charakterisierung der Interaktion des Hepatitis C viralen Proteins NS5A mit der humanen Tyrosinkinase c-SRC
| Titel: | Untersuchung und Charakterisierung der Interaktion des Hepatitis C viralen Proteins NS5A mit der humanen Tyrosinkinase c-SRC | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44692 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20190220-114731-2 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Klinker, Stefan [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Willbold, Dieter [Gutachter] Prof. Dr. J. G. Bode [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Vorhergehende Studien mit Hepatozyten Zelllinien mit stabil inkorporiertem Hepatitis C Virus- Replikongenom (Huh 9-13) zeigten, dass die humane Tyrosinkinase c-SRC durch die viralen
Proteine NS5A und NS5B in den viralen Replikationskomplex rekrutiert wird. Die Ausbildung des Komplexes ist essentiell für die virale Replikation. Im Komplex mit den viralen Proteinen steht c-SRC nicht für die physiologischen Funktionen zur Verfügung, zu denen unter anderem die Beteiligung an Signalwegen für die Zellproliferation, Zelldifferenzierung und Zellüberleben gehören. Ausgehend von Studien zur Bindung von NS5A an c-SRC-SH2 in Hepatozyten und NS5A an FYN-SH2 in B-Zelllymphozyten, wird ein Phosphotyrosin (pY) -abhängiger Mechanismus der Bindung vermutet. Ziel dieser Arbeit war es, die Bindung zwischen NS5A und c-SRC-SH2 zu untersuchen, die entscheidende Interaktionsstelle zu identifizieren und biochemisch zu charakterisieren. Über Pulldown-Assays mit pY-bindedefiziente Varianten von c-SRC-SH2 und FYN-SH2 konnte eine klar pY-abhängige Bindung von NS5A gezeigt werden. Um die Hypothese zu überprüfen, wurde die Bindung von synthetischen NS5A-pY-Peptiden an c-SRC-Domänen qualitativ und quantitativ untersucht. So wurden mehrere putative Bindestellen mit Dissoziationskonstanten (Kds) im niedrigen μM-Bereich identifiziert. Drei der Epitope befanden sich in der D1-Domäne (Y93, Y129, Y161) und eins in der D3-Domäne (Y413). Über Strukturdaten zur D1-Domäne wurde die Oberflächenzugänglichkeit der Tyrosine bestätigt. Nachfolgend wurden D1- und D2D3-Domänen von NS5A im mg-Maßstab mit pY-Modifikationen heterolog exprimiert und gereinigt. Die Expression wurde im E. coli-Stamm TKB-1 durchgeführt, welcher neben dem „protein of interest“ die Tyrosinkinase ELK co-exprimiert, die unspezifisch co- und posttranslationell in vivo Tyrosinreste phosphoryliert. Durch diese unspezifische Phosphorylierung konnte nicht von homogen modifizierten Tyrosinresten ausgegangen werden. Dieser Umstand wurde im Design der weiteren Experimente berücksichtigt. Über in vitro-Assays wurde die Bindung von NS5A-D1 ELK pY und -D2D3 ELK pY an c-SRC-SH2 qualitativ durch Pulldown-Assays und quantitativ durch Biolayer-Interferenz (BLI) gemessen. Dabei wurden Kds von ~ 500 nM für NS5A-D1 ELK pY an c-SRC-SH2 gemessen. Kontrollexperimente, mit unphosphorylierten oder pY-bindedefiziente Analyten, zeigten eine klare pY-Abhängigkeit der Bindung. Für NS5A-D2D3ELK pY konnte lediglich eine Bindungkonstante im mittleren μM-Bereich (Kd =18 μM) für c-SRC-SH2 gemessen werden. Um das für die Bindung entscheidende Tyrosin in NS5A-D1 einzugrenzen, wurden die drei Kandidaten Y93, Y129 und Y161 durch Phenylalanine ausgetauscht. Diese Varianten von NS5A-D1ELK pY wurden auf c-SRC-SH2-Bindung untersucht. Varianten mit Y93F-Austausch zeigten den Verlust der μM-Affinität zu c-SRC-SH2, wohingegen Y93 ELK pY -Varianten Wildtyp-ähnliche Affinitäten aufwiesen (Kd ~ 0,5-1,5 μM). Zusammenfassend deuten die Ergebnisse der in vitro-Bindungsstudien darauf hin, dass Y93 nach Phosphorylierung Teil des c-SRC-SH2-Bindeepitops von NS5A ist. Anschließend wurden Experimente zur biologischen Relevanz in Zellkultur-Replikonsmodellen durchgeführt. Dazu wurden Hepatozyten-Zelllinien (Huh 7) mit HCV-Replikon-Plasmiden, mit NS5A Y93F-Austausch, transfiziert. Es zeigte sich, dass die Replikationseffizienz von HCV, verglichen mit dem wt-HCV-Replikon-Plasmid oder stabil transfizierten Huh 9-13-Hepatozyten, reduziert wurde. Austausche für Y129 und Y161, jeweils zu F, zeigten keine statistisch signifikanten Änderungen der Replikationsraten.Previous results provided strong evidence that in hepatitis C virus (HCV) infected cells the cellular tyrosine kinase c-SRC is recruited into the viral replication machinery by the viral nonstructural proteins NS5A and NS5B. Thereby, c-SRC participates in the formation of a NS5A/NS5B protein complex that is a prerequisite for efficient HCV replication. This likely interferes with the physiological function of the ubiquitously expressed c-SRC that governs a variety of important cellular processes e.g. with cellular proliferation, differentiation or cell survival. Recently, it has been shown for HCV infected hepatocytes that NS5A binds to c-SRC-SH2 and in HCV infected B-cell lymphocytes NS5A binds FYN-SH2, leading to the assumption that NS5A interacts with SH2 domains via phosphotyrosine (pY) modification. The aim of this work to investigate the binding of NS5A and c-SRC-SH2, identify and characterize biochemically the important interaction site. Pull-down assays with different SH2 domains and non-pY binding variants of SH2 domains were performed and showed a pY dependent binding of NS5A for SH2 domains. Tyrosine phosphorylated peptides covering NS5A sequence and mg-scale of recombinant purified c-SRC-SH2 domains were used for different methods of screening putative binding motives of NS5A and c-SRC. ELISA, fluorescence polarization measurements and biolayer interferometry (BLI) were used to measure binding qualitativly and quantitativly. The result suggested several candidate binding sites for c-SRC-SH2 with low μM binding affinities, three in D1 (Y93, Y129, Y161) and one in D3 (Y413). Structural information of NS5A-D1 suggested that all of the three D1 candidates were exposed to the protein surface. Based on these peptide screenings, different boundaries of NS5A were purified in milligram scale in various post-translational modified pY states. This modification of protein was achieved by using E. coli TKB-1 strain which co-expresses ELK-kinase for unspecific phosphorylation of protein of interested in vivo during biosynthesis. Previous studies showed some inhomogeneity of pY modification pattern, therefore following experiments were designed considering this. In vitro binding assays with recombinant components were performed and measuring qualitatively (pull-down assays) and quantitatively (BLI). Dissociation constants (Kds) of ~500 nM were observed for c-SRC-SH2 and NS5A-D1ELK pY wt. Control experiments without phosphorylation modification of NS5A as well as experiments with non-pY binding variants of SH2 showed clear pY-dependence for binding. For NS5A-D2D3ELK pY (with pY413) a Kd of 18 μM for c-SRC-SH2 was observed, therefore nearly factor 40 less affine. Based on NS5A-D1 domain different Y to F mutants (Y93F, Y129F, Y161F) were designed to inhibit phosphorylation whereas protein structure stayed unharmed. Single, double and triple Y to F mutants were tested for c-SRC-SH2 binding capabilities. NS5A-D1 ELK pY Y93F variants showed lost of affinity for c-SRC-SH2. The affinity changed from Kd ~ 1 μM when Y93ELK pY was present to 30 μM in D1 Y93F ELK pY variants, showing that pY93 is a high affinity docking side for c-SRC-SH2. Knowledge of the interaction side is the first step for clarification of the structural basis of the c-SRC NS5A complex. First in vivo studies were performed using Huh 7 hepatocytes transfected with HCV replicon plasmids with D1 Y93F exchange. Cells showed reduced replication rate compared with Huh 7 with wt plasmid or Huh 9-13 stable replicon cells. D1 positions Y129F and Y161F leading to no statistical significant change in replication. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät » WE Biologie » Physikalische Biologie | |||||||
| Dokument erstellt am: | 20.02.2019 | |||||||
| Dateien geändert am: | 20.02.2019 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 07.12.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 23.01.2018 |
