Dokument: Charakterisierung des Differenzierungspotentiales humaner epikardialer Progenitorzellen aus atrialen Biopsien
| Titel: | Charakterisierung des Differenzierungspotentiales humaner epikardialer Progenitorzellen aus atrialen Biopsien | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44653 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20180118-105518-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | MA Sc. Schmidt, Timo Daniel [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Schrader, Jürgen [Gutachter] Prof. Dr. Martin, William F. [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie | |||||||
| Beschreibungen: | Der Herzinfarkt ist nach wie vor eine der häufigsten Todesursachen in den Industrienationen.
Verursacht wird er durch Verschluss eines Herzkranzgefäßes, der die Versorgung des nachgeschalteten Gewebes mit Blut unterbricht und so einen Gewebeuntergang herbeiführt. Durch Proliferation von extrazellulärer Matrix (ECM)-produzierenden Myofibroblasten wird eine nichtkontraktile Infarktnarbe ausgebildet, welche zwar das Herz vor einer Ruptur bewahrt, jedoch langfristig zu einer Herzinsuffizienz führen kann. Da Kardiomyozyten nur ein sehr geringes Potential zur Proliferation besitzen, ist eine Regeneration des geschädigten Infarktareals durch körpereigene, d.h. endogene, Stammzellen ein möglicher Ansatzpunkt der Forschung und zukünftigen Therapie. Endogene Vorläuferzellen aus epikardialen Zellen (epicardium-derived cells, EPDC) tragen entscheidend zur Entstehung des Herzens während der Embryonalentwicklung bei, sie gehen jedoch nach der Geburt in einen Ruhezustand über. Durch eine ischämische Herzschädigung wie nach einem Infarkt reaktivieren die EPDC ihr embryonales Programm und versuchen, wenn auch nicht erfolgreich, zu einer Regeneration des Herzens beizutragen. Dazu gehört neben der Differenzierung in Endothelzellen, glatte Muskelzellen aber auch Kardiomyozyten, die Modulation der Immunantwort nach Infarkt durch die Sekretion von Zytokinen. Ziel dieser Arbeit war es, die EPDC aus humanen atrialen Biopsien zu isolieren und sie hinsichtlich verschiedener molekularer Marker zu charakterisieren, um ihr regeneratives Potential besser abschätzen zu können. Im Vergleich zu humanen EPDC wurden auch ventrikuläre murine EPDC isoliert und charakterisiert, um Gemeinsamkeiten bzw. Speziesdifferenzen herauszuarbeiten. Folgende wesentliche Ergebnisse wurden erzielt: · Zunächst wurde eine Methode entwickelt und validiert, um EPDC aus humanen atrialen Biopsien zu isolieren und diese in Kultur zu passagieren. Dabei zeigte sich, dass die Zellen einen homogenen mesenchymalen Phänotyp besitzen, eine Verdopplungszeit von 47±6 Stunden zeigen und sich über 10-12 Wochen in Kultur vermehren lassen. · Zellmarkeruntersuchungen mittels Durchflusszytometrie, mRNA-Analyse und Immunfluoreszenzanalyse zeigten die Expression von epikardialen Markern wie WT1 und Tbx18 sowie die Expression des kardialen Markers GATA4, was ihren epikardialen Ursprung belegt. · Untersuchungen mit fluoreszenzmarkierten Nanopartikeln zeigten, dass humane EPDC ein endozytotisches Potential besitzen, welches in seiner Stärke mit dem von humanen mesenchymalen Stammzellen (MSC) vergleichbar ist. EPDC, die in das Infarktareal einwandern, könnten somit an der Beseitigung von z. B. apoptotischen/nekrotischen Zellen mitwirken. · Analysen des Zellkulturüberstands von EPDC zeigten, dass sie verschiedene Zytokine, welche bei Entzündung (IL-6, IL-1β, IL-11, MCP1), Angiogenese (VEGF) und Differenzierung (TGF-β) involviert sind, sezernieren. · Eine Oberflächenproteomanalyse zeigte, dass von allen identifizierten Proteinen 149 sowohl von hEPDC als auch rEPDC exprimiert werden. Die Expression verschiedener Rezeptoren für Wachstumsfaktoren (EGFR, PDGFR) und an Differenzierungsprozessen beteiligter Signalmoleküle (NRP1, Notch2, Endoglin) konnte nachgewiesen werden. Ebenfalls wurden ECM-modulierende Enzyme (MMP2, MMP14) identifiziert, was auf eine mögliche Beteiligung der hEPDC an Gewebeumbildungen hinweist. · Die lentivirale Immortalisierung von humanen EPDC mit hTERT resultierte in einer schnell wachsenden Zelllinie, welche sich jedoch in ihrer Markerexpression von primären EPDC deutlich unterscheidet. Insgesamt konnten humane EPDC erfolgreich aus atrialen Biopsien isoliert werden. Kultivierte EPDC sezernierten verschiedener Zytokine, welche an der Modulation der Immunantwort nach einem Infarkt beteiligt sein könnten bzw. die Regeneration des Herzens nach der Verletzung fördern können. Weiterhin konnten Oberflächenproteine identifiziert werden, welche auf eine Beteiligung der EPDC an wesentlichen Prozessen der Proliferation und Differenzierung nach Herzinfarkt hinweisen.Cardiac infarction is still one of the leading causes of death in western societies. It is caused by the occlusion of a coronary artery, resulting in a lack of oxygen supply in downstream cardiac tissue and the death of cardiomyocytes. A non-contractile scar is formed by proliferation of particularly ECMproducing myofibroblasts. This prevents a rupture of the injured heart, but may eventually lead to heart failure in the long term. Since cardiomyocytes themselves only show a very limited proliferation potential, regeneration of injured cardiac tissue by endogenous stem cells is a focus of current cardiac research. Endogenous stem cells of the epicardium (epicardium-derived cells, EPDC) play a crucial role during embryonic development of the heart, but become quiescent shortly after birth. However, EPDC can reactivate their embryonic program after cardiac injury and therefore may contribute to cardiac regeneration. This includes in addition to differentiation of EPDC to endothelial cells, smooth muscle cell and cardiomyocytes the modulation of the immune response through secretion of cytokines. The aim of this thesis was to isolate EPDC from human atrial biopsies and to characterize at the gene and protein level their regenerative potential. In comparison to human EPDC, rat EPDC formed on the ventricular myocardium after infarction were characterized in parallel. The following main results were obtained: · A method for isolation and cultivation of EPDC from human atrial biopsies obtained from surgical specimens was established. Isolated cells revealed a homogenous mesenchymal phenotype and showed a doubling time of 47±6 hours and could be cultured for up to 10-12 weeks. · Analysis of cell markers with flow cytometry, qRT-PCR and immunofluorescence showed the expression of epicardial markers such as WT1 and Tbx18 as well as cardiac markers such as GATA4, substantiating their epicardial origin. · Experiments with fluorescence-labeled nanoparticles revealed an endocytotic potential comparable to human MSC. This suggests the involvement of EPDC in the removal of cell debris and apoptotic cells. · Analysis of the cell culture supernatant revealed the secretion of various cytokines involved in inflammation (IL-6, IL-1β, IL-11, MCP1), angiogenesis (VEGF) and differentiation processes (TGF-β). · A surface proteome analysis revealed that from all proteins identified, 149 were expressed on both human and murine EPDC. They include receptors for growth factors (EGFR, PDGFR) as well as receptors for molecules involved in differentiation processes (NRP1, Notch2, Endoglin). In addition, enzymes known to modulate ECM (MMP2, MMP14), were identified in both human and rat EPDC. · Lentiviral immortalization of human EPDC with hTERT resulted in a fast growing cell-line which differed from primary EPDC in the expression of several marker proteins. Overall, human EPDC were successfully isolated and characterized from human atrial biopsies. They secreted numerous cytokines known to be involved in the modulation of the immune response and regeneration of the heart after injury. Furthermore, surface proteome analysis identified proteins involved in essential mechanisms of cell proliferation and differentiation. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 18.01.2018 | |||||||
| Dateien geändert am: | 18.01.2018 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 05.10.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 07.12.2017 |
