Dokument: Mechanismus der K+ Kopplung in excitatory amino acid transporters

Titel:	Mechanismus der K+ Kopplung in excitatory amino acid transporters
Weiterer Titel:	Mechanism of K+ coupling in excitatory amino acid transporters
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44633
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20180122-102559-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Kortzak, Daniel [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 14,46 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 15.01.2018 / geändert 15.01.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Fahlke, Christoph [Gutachter] Prof. Dr. Gohlke, Holger [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 510 Mathematik
Beschreibungen:	Excitatory amino acid transporters (EAAT) beenden die Signalübertragung in glutamatergen Synapsen durch das Entfernen von Glutamat aus dem synaptischen Spalt. Sie nutzen die Energie, die in Na+- und K+-Konzentrationsgradienten gespeichert ist, für sekundär-aktiven Glutamattransport. Die mit K+ assoziierten Schritte sind ratenlimitierend und stellen daher ein vielversprechendes pharmakologisches Ziel dar, um EAAT-Transportraten zu modifizieren. In dieser Arbeit werden Molekulardynamiksimulationen (MD) von prokaryotischen EAAT-Homologen mit Patch-Clamp-Messungen von EAAT2 kombiniert, um die molekularen Mechanismen des K+-gekoppelten Glutamattransports zu identifizieren. Simulationen des prokaryotischen Homolog GltPh zeigen spontane K+ Assoziation an drei verschiedenen Bindestellen (K1--K3). K1 und K2 überlappen teilweise mit bekannten Na+ Bindestellen. Weiter zeigen die Simulationen, dass Bindung and K2 oder K3 Voraussetzung für die Besetzung von K1 ist. Bindung an K1 schwächt die Bindung an den anderen Stellen, während die Bindung an K1 sehr stabil ist. Bindungsenergieberechnungen bestätigen, dass K1 die höchste Affinität hat. Diese Resultate suggerieren, dass K1 als finale Bindestelle dient, die während der Konformationsänderung von einwärts- nach auswärts-zeigendem Zustand besetzt ist. Die vorhergesagten K+ Bindestellen wurden durch die Kombination von in silico mit in vitro Mutagenese, Proteinaufreinigung und Microscale Thermophorese von GltPh oder heterologer Expression und Patch-Clamp-Experimente von EAAT2 getested. Mutationen die in MD Simulationen zu verringerten Bindungsenergien führen, zeigen auch im Experiment keine K+ Bindung von GltPh und keine K+ aktivierten Ströme von EAAT2. Dies zeigt, dass die K1 Bindestelle in GltPh und den EAATs konserviert ist, und dass Simulationen von GltPh genutzt werden können, um die K+ Kopplung in EAATs zu untersuchen. Die Ergebniss aus den Experimente stimmen mit Bindungsenergieberechnungen aus \textit{in silico} Mutagenese überein. Simulationen zeigen, dass die Bindung an K1 das Tor zu der Glutamat-Bindestelle schließt, was eine Bedingung für die Translokation über die Membran ist. Unterschiede im Gleichgewicht der Toröffnung und -schließung erklären strikte K+ Kopplung der EAATs und K+ unabhängigen Transport von GltPh. Durch die Kombination von Experimenten und Simulationen wurden die K+-Bindestellen und der Mechanismus der K+ Kopplung in EAATs identifiziert. Excitatory amino acid transporters (EAAT) terminate signal transmission in a glutamatergic synapse by removal of glutamate from the synaptic cleft. They harness the energy stored in pre-existing Na+and K+ concentration gradients to drive secondary active glutamate transport. The K+-associated steps are rate-limiting for glutamate transport and represent promising pharmacological targets to modify EAAT transport rates in various human disease conditions. We here combined extensive molecular dynamics (MD) simulations of prokaryotic EAAT homologs and patch-clamp recordings of mammalian EAAT2 to identify the molecular mechanisms of K+-coupled glutamate transport. Simulations of the prokaryotic homolog GlhPh show spontaneous association of K+ to three distinct K+ binding sites (K1–K3). K1 and K2 partly overlap with established Na+binding sites Na1 and Na2. Unbiased simulations suggest that association to K2 or K3 is a precondition for binding at K1, and that K+ binding at K1 weakens binding at the other sites, while a K+ ion remains stably bound at K1. Free energy calculations confirmed that K1 has the highest affinity. These results suggest that K1 serves as the final binding site that is occupied during the isomerization between inward- and outward-facing conformations. We tested the predicted K+ binding sites by combining in silico mutagenesis with in vitro mutagenesis, protein purification and microscale thermophoresis on GlhPh or heterologous expression and whole-cell patch-clamp recordings of EAAT2. Mutations that cause reduced free energies of binding in simulations also abolished K+ binding of GlhPh and K+ activated currents in EAAT2. We conclude that the K1 site is conserved in GlhPh and EAATs and that we can use simulations of GlhPh to investigate K+ coupling in EAATs. Simulations reveal that occupation of K1 closes the gate to the neurotransmitter binding site, which is a perquisite for translocation across the membrane. Differences in the equilibrium between gate opening and closing account for obligate K+ coupling in EAATs and K+ independent transport in GlhPh. In conclusion, the combination of experimental and computational methods successfully resolved the K+ binding sites as well as the mechanism of K+ coupling in EAATs.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	22.01.2018
Dateien geändert am:	22.01.2018
Promotionsantrag am:	29.10.2013
Datum der Promotion:	14.12.2017