Dokument: Photocaged compounds as versatile tools for light-controlled gene expression in bacteria

Titel:	Photocaged compounds as versatile tools for light-controlled gene expression in bacteria
Weiterer Titel:	Photocaged compounds als vielseitige Werkzeuge zur Licht-gesteuerten Genexpression in Bakterien
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44566
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20190212-112407-7
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Deutsch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Binder, Dennis [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 88,64 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.01.2018 / geändert 05.01.2018
Beitragende:	Prof. Dr. Jaeger, Karl-Erich [Gutachter] Prof. Dr. Pietruszka, Jörg [Gutachter]
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Optogenetic tools are light-responsive components that allow for a simple triggering of cellular functions with unprecedented spatiotemporal resolution and in a non-invasive fashion. In this context, photocaged compounds, which release bioactive molecules upon short light exposure, are highly valuable tools for setting up light control and thus regulating and studying crucial bio(techno)logical processes such as gene expression. Due to the unique potential of light to achieve a stringent control of cellular processes, this thesis was concerned with the overall aim to establish light-controlled bacterial expression systems based on photocaged compounds. Initially, different inducible expression systems were characterized in-depth using microfluidic single-cell analysis and subsequently reengineered towards beneficial expression features such as system tightness or population homogeneity. Consequently, different light-controlled expression tools were established based on Plac/LacI, PBAD/AraC and PrhaBAD/RhaRS promoter/regulator systems in Escherichia coli using photocaged derivatives of IPTG, arabinose, galactose, rhamnose and glucose. Here, gene expression was monitored by means of fluorescent reporter based online monitoring and further tuned towards a rapid and highly dynamic control. Essentially, single-cell analyses indicated that by applying photocaged carbohydrates, conventional chemical induction mostly gets superseded at the level of population heterogeneity, expression strengths and temporal resolution. Finally, established optogenetic tools were transferred to alternative expression hosts such as Corynebacterium glutamicum and first biotechnological productions such as flavoring terpenoid and secondary metabolite antibiotic biosyntheses. Conclusively, photouncaging is a sophisticated approach to achieve a gradually adjustable, non-invasive, spatiotemporal and thus high-throughput feasible fine control of simple to complex biological processes within bacterial cultures in picoliter- to liter-scale. In the future, several special applications such as high-throughput screenings as well as closed or multimodal processes are predestined for optogenetic control. Inevitably, plenty of prospective synthetic bio(techno)logical tasks in different key microbes arise for the newly developed and versatile plug-and-play expression toolbox mediating light-controlled gene expression via photocaged compounds. In der Optogenetik ermöglichen molekulare Lichtschalter eine unkomplizierte und nicht-invasive Ansteuerung von zellulären Funktionen mit einer enormen räumlichen und zeitlichen Auflösung. Durch die Kopplung mit Licht-sensitiven chemischen Schutzgruppen können sogenannte photocaged compounds bioaktive Moleküle nach kurzer Belichtung freisetzen. Folglich sind diese Verbindungen geeignete molekulare Werkzeuge, um eine solche Lichtsteuerung zu realisieren und somit wichtige bio(techno)logische Prozesse, wie etwa die Genexpression, zu regulieren und zu erforschen. Aufgrund dieses einzigartigen Potenzials von Licht eine höhere Form der Kontrolle über zelluläre Prozesse zu erzielen, wurde in dieser Arbeit das übergeordnete Ziel verfolgt, Licht-gesteuerte bakterielle Expressionssysteme basierend auf photocaged compounds zu etablieren. Zunächst wurden unterschiedliche induzierbare Expressionssysteme mithilfe mikrofluidischer Einzelzellanalysen eingehend charakterisiert und anschließend hinsichtlich gewünschter Expressionseigenschaften, wie etwa der strikten Kontrolle des Promotors oder einer erhöhten Homogenität der Zielgenexpression innerhalb einer bakteriellen Population, optimiert. Infolgedessen wurden unterschiedliche lichtgesteuerten Expressionssysteme basierend auf Plac/LacI, PBAD/AraC und PrhaBAD/RhaRS Promotor/Regulator-Kombinationen in Escherichia coli unter Verwendung von photo-aktivierbaren IPTG-, Arabinose-, Galactose-, Rhamnose- und Glucose-Derivaten etabliert. Hierbei wurde die Genexpression während der Kultivierung mithilfe Fluoreszenzreporter-basierter Online-Überwachung verfolgt und anschließend ausgewählte Systeme in Hinblick auf ein schnelles und hochdynamisches Ansprechverhalten verbessert. Grundlegend konnte dabei mittels Einzelzellanalysen aufgezeigt werden, dass die photocaged compounds herkömmliche chemische Induktoren hinsichtlich der Populationshomogenität, der Expressionsstärke sowie der zeitlichen Auflösung des jeweiligen Expressionssystems zumeist deutlich übertreffen. Abschließend wurden etablierte optogenetische Werkzeuge auf alternative Expressionswirte wie etwa Corynebacterium glutamicum sowie auf erste Produktionen biotechnologisch relevanter Terpenoide und Antibiotika übertragen. Zusammengefasst haben sich photocaged compounds als ausgeklügelte Werkzeuge etabliert, um eine graduell steuerbare, nicht-invasive, zeitlich und räumlich hoch aufgelöste und somit Hochdurchsatz-fähige Feinsteuerung von einfachen und komplexen biologischen Prozessen im Pikoliter- bis Liter-Maßstab zu erzielen. In Zukunft sind einige spezielle Anwendungen wie etwa Hochdurchsatz-Screenings sowie geschlossene oder multimodale Prozesse in besonderem Maße für eine optogenetische Steuerung qualifiziert. Zwangsläufig ergeben sich viele potenzielle Anwendungen im Bereich der synthetischen Bio(techno)logie sowie in verschiedenen relevanten Mikroorganismen für die hier neu entwickelten und vielseitigen optogenetischen Werkzeuge zur Vermittlung einer lichtgesteuerten Genexpression mithilfe von photocaged compounds.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	12.02.2019
Dateien geändert am:	12.02.2019
Promotionsantrag am:	07.11.2016
Datum der Promotion:	07.11.2016