Dokument: Analysis of tumor-specific mutations in liquid biopsies - Exploring the value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA for early diagnosis in pancreatic cancer
| Titel: | Analysis of tumor-specific mutations in liquid biopsies - Exploring the value of circulating tumor cells and circulating tumor DNA for early diagnosis in pancreatic cancer | |||||||
| Weiterer Titel: | Analyse tumorspezifischer Mutationen in der Flüssigbiopsie (liquid biopsy) - Vergleich von zirkulierenden Tumorzellen und zirkulierender Tumor-DNA für die Frühdiagnose im Pankreaskarzinom | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44376 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20171218-160829-0 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Englisch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Brychta, Nora [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Kassack, Matthias U. [Gutachter] Prof. Dr. Stoecklein, Nikolas Hendrik [Gutachter] | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 500 Naturwissenschaften und Mathematik » 540 Chemie | |||||||
| Beschreibungen: | Pankreaskarzinom (PK) ist eine fatale Erkrankung. Trotz jahrzehntelanger Forschung ist eine Resektion des Tumors bisher die einzige kurative Behandlung, die nur in frühen Stadien des PK möglich ist. Die Diagnose erfolgt meistens in inoperablen späten Stadien auf Grund von unspezifisch auftretenden Symptomen und Mangel an minimal-invasiven sensitiven Diagnosetechniken. Hoch-invasive Tumorbiopsie ist der Goldstandard für die Erstellung der Diagnose, welche allerdings in PK schwierig zu erhalten ist. Eine
Alternative könnten Blut-basierte Analysen sein, welche die Krankheit systemisch durch minimal-invasive Blutentnahme repräsentiert. Im Gegensatz zu Tumorbiopsien kann die Flüssigbiopsie (Liquid Biopsy) wiederholt werden und hat daher das Potential für eine sequentielle Frühdiagnose. Eine periphere Blutprobe enthält z.B. zirkulierende Tumor DNA (ctDNA) und zirkulierende Tumorzellen (CTCs), welche vom Primärtumor oder einer Metastase stammen. In dieser Arbeit wurde die diagnostische Sensitivität von hoch-prävalenten KRAS (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog)-Mutationen sowohl in ctDNA als auch in CTCs in Frühstadien des PK evaluiert. In einem ersten Ansatz ergab die Isolierung von synthetisch-mutierten Allelen, die in Plasma überführt wurden, mit anschließender Mutationsdetektion durch digitale PCR, dass fünf mutierte Allele über einen optimierten Workflow detektiert werden können. Fünfzig Plasma- und zugehörige Tumorproben von Patienten in überwiegend frühen Stadien des PK wurden auf KRAS-Mutationen analysiert. In 35% der Fälle wurde die Mutation im Tumor ebenfalls im Plasma detektiert. Die Analyse von ctDNA zeigt damit eine gesteigerte minimal-invasive Sensitivität zur potentiellen Frühdiagnose in PK auf. In einem zweiten Ansatz wurde eine EpCAM (epithelial cell adhesion molecule)-basierte (IsoFlux) Methode mit einer größenabhängigen Methode (automatisierte Filtration durch Siemens-Einheit) auf die Isolierung von PK-Zellen verglichen, wobei die Filtration überlegen war. Arbeitsschritte für anschließende Mutationsanalysen durch digitale PCR wurden etabliert, um mutiertes KRAS in isolierten Einzel-CTCs zu bestimmen. Gefrorenes Produkt der CTC-angereicherten diagnostischen Leukapherese (DLA) von PK-Patienten wurde auf CTC-Anzahl getestet. In 42% der Patientenproben konnten CTCs detektiert werden, wobei 40% in nicht-metastatischen Patienten isoliert werde konnten. Gefrorenes DLA-Produkt stellt damit eine lagerbare Quelle für CTC-Analysen dar. Alle getesteten CTCs waren übereinstimmend mit dem Tumor KRAS-negativ. In einem weiterführenden Exkurs wurden CTCs für das Monitoring und die Anwendung in personalisierter Medizin in fortgeschrittenen Stadien des Lungenkrebs positiv evaluiert. Erhöhte CTC-Zahlen wurden durch eine in vivo Methode erhalten. Zusätzlich wurden Mutationen in CTCs zur Überwachung der Therapie erfolgreich detektiert. Zusammenfassend zeigen die Daten, dass ctDNA ein möglicher diagnostischer, sensitiver und minimal-invasiver Marker ist, der CTCs in klinischem Nutzen und klinischer Durchführbarkeit in PK überlegen ist. Der Wert dieser Ergebnisse sollte in weiterführenden Studien besonders an Proben von klinisch unauffälligen Personen vertieft werden.Pancreatic cancer (PC) is a devastating disease. Despite decades of research, resection of the tumor is still the lone curative treatment only feasible in early stages of PC. Diagnosis is usually at inoperable late stages due to unspecific symptoms and the lack of minimally invasive sensitive diagnostic techniques. Highly invasive tumor biopsy is the gold standard for diagnosis but difficult to obtain in PC. An alternative tool might be blood-based liquid biopsies which represent the disease systemically by minimally invasive blood draw. In contrast to tumor biopsies, liquid biopsy can be repeated and therefore might have the potential for sequential early diagnostics. A peripheral blood sample contains e.g. circulating tumor DNA (ctDNA) and circulating tumor cells (CTCs) originating from the primary tumor or metastasis. In this thesis, the diagnostic sensitivity of highly prevalent KRAS (Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog) mutations was evaluated in both ctDNA and CTCs in early stages of PC. In a first approach, after establishment of an optimized workflow isolation of synthetic mutant alleles spiked in plasma following subsequent mutation detection by digital PCR revealed that a minimum of 5 mutant alleles could be detected from plasma. Fifty samples each of plasma and matched tumor tissue from fifty PC patients diagnosed predominantly at early stages were analyzed for KRAS mutations. In 35% of cases the mutation detected in tumor was concordantly found in plasma. The analysis of ctDNA provides increased minimally invasive sensitivity as potential early diagnostic marker in PC. In a second approach, an EpCAM (epithelial cell adhesion molecule)-based (IsoFlux) and size-based method (automated filtration unit by Siemens) were compared for isolation of different PC cells whereby filtration was superior. A workflow for subsequent downstream analysis by digital PCR was established to detect mutant KRAS in isolated single CTCs. Frozen CTC-enriched diagnostic leukapheresis products (DLA) from patients diagnosed with PC were then analyzed for CTC number. 42% of patients were CTC-positive therein 40% in non-metastatic patients providing a storable medium of CTC-analysis. All tested CTCs were KRAS-negative concordant to the analyzed tumor. As a continuative excursus, CTCs were positively evaluated for monitoring and application to personalized medicine in advanced stages of lung cancer. Increased CTC numbers were obtained by an in vivo isolation technique. Additionally, mutations in CTCs for monitoring of therapies were successfully detected. In summary, these findings suggest ctDNA as a sensitive, minimally invasive early diagnostic marker for PC outperforming CTCs in terms of clinical utility and feasibility. The value of these findings especially in samples of apparently healthy individuals should be the aim of future research. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 18.12.2017 | |||||||
| Dateien geändert am: | 18.12.2017 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 07.07.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 15.11.2017 |
