Dokument: Corynebacterium glutamicum - a novel platform for the production of plant polyphenols

Titel:	Corynebacterium glutamicum - a novel platform for the production of plant polyphenols
Weiterer Titel:	Corynebacterium glutamicum - eine Plattform zur Produktion pflanzlicher Polyphenole
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44350
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20171208-125130-5
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	M. Sc. Kallscheuer, Nicolai [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 19,47 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 05.12.2017 / geändert 05.12.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Bott, Michael [Betreuer/Doktorvater] PD Dr. Pohl, Martina [Gutachter]
Stichwörter:	Corynebacterium glutamicum, Polyphenole
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Plants synthesize a large diversity of more than 200,000 different secondary metabolites, which can be subdivided into terpenoids, alkaloids and polyphenols. Especially polyphenols demonstrate important pharmacological activities. Unfortunately, these compounds are produced only in small amounts rendering the extraction from plant material economically not viable. The natural synthesis of polyphenols such as stilbenes and flavonoids starts from phenylpropanoids, which in turn are obtained from aromatic amino acids. The main goal of this thesis was to exploit the yet untapped potential of Corynebacterium glutamicum, an industrial workhorse for amino acid production, for the synthesis of plant polyphenols by functional integration of heterologous pathways. To this end, the following results were obtained: (1) Initial attempts to produce the stilbene resveratrol from the phenylpropanoid p-coumaric acid in C. glutamicum failed. It turned out that an unknown degradation pathway allowed C. glutamicum to grow with phenylpropanoids as sole carbon and energy source. The expression of a gene cluster coding for enzymes of unknown function was highly upregulated in presence of phenylpropanoids. It could be shown that the enzymes catalyze a CoA-dependent, β-oxidative side chain shortening of phenylpropanoids yielding benzoic acids, which are further degraded by well-characterized pathways in C. glutamicum. In addition to the identified pathway, the complex network for the degradation of aromatic compounds in C. glutamicum interfered with the desired production of polyphenols. To this end, a novel platform strain unable to degrade aromatic compounds (designated C. glutamicum DelAro4) was constructed by deleting altogether 21 genes in four clusters in the genome. (2) Plasmid-borne expression of genes coding for heterologous enzymes from different plant species enabled production of stilbenes (pinosylvin, resveratrol and piceatannol) as well as of (2S)-flavanones (naringenin and eriodictyol) depending on the supplemented phenylpropanoid in different strains derived from C. glutamicum DelAro4. Stilbene and (2S)-flavanone titers of up to 158 mg/L and 37 mg/L could be achieved, respectively. The production of O-methylated stilbenes and of more complex flavonoids could be demonstrated by introduction of additional genes. The obtained product titers of the flavonols quercetin (10 mg/L) and kaempferol (23 mg/L) exceeded the highest titers produced in engineered microorganisms so far. (3) Microbial production of resveratrol and naringenin with C. glutamicum could be achieved starting from glucose by deregulation of the shikimate pathway to achieve intracellular accumulation of aromatic precursor amino acids. A heterologous tyrosine ammonia lyase (TAL) connected the endogenous aromatic amino acid metabolism to the production of phenylpropanoid-derived polyphenols. The TAL activity was rate-limiting during polyphenol production from glucose. To circumvent the bottleneck at the stage of phenylpropanoid synthesis, a novel synthetic pathway for the production of the direct polyphenol precursor p-coumaroyl-CoA starting from the cheap 4-hydroxybenzoic acid was first designed in silico and then functionally introduced in C. glutamicum. The pathway is the non-natural reversal of a bacterial degradation pathway for phenylpropanoids and requires only acetyl-CoA and cofactors such as ATP and NADH. Initially, 5 mg/L resveratrol could be produced from 4-hydroxybenzoic acid using this novel pathway. Pflanzen synthetisieren mehr als 200.000 verschiedene Sekundärmetabolite, die aufgrund ihrer molekularen Struktur in die großen Gruppen der Terpenoide, Alkaloide und Polyphenole unterteilt werden können. Insbesondere Polyphenole haben pharmakologisch interessante Eigenschaften, werden aber von Pflanzen nur in so geringen Mengen produziert, dass eine Extraktion von Polyphenolen aus Pflanzenmaterial insgesamt unwirtschaftlich ist. Die Polyphenol-Synthese in Pflanzen startet von aromatischen Aminosäuren, aus denen zunächst Phenylpropanoide gebildet werden. Diese dienen dann als Vorstufen für die Synthese der Polyphenole. Durch funktionale Integration heterologer Stoffwechselwege aus Pflanzen können Polyphenole auch mit Hilfe genetisch veränderter Mikroorganismen produziert werden. Corynebacterium glutamicum ist ein vielversprechender Wirtsorganismus für die Polyphenol-Produktion, da er heutzutage bereits industriell zur Synthese von Aminosäuren genutzt wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die folgenden Ergebnisse zur Polyphenol-Produktion mit C. glutamicum erzielt: (1) Anfängliche Versuche zur Synthese des Stilbens Resveratrol aus dem Phenylpropanoid p-Cumarsäure scheiterten. Weitergehende Experimente zeigten, dass ein bisher unbekannter Abbauweg für Phenylpropanoide das Wachstum von C. glutamicum mit diesen aromatischen Substanzen als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle ermöglichte und dadurch die Stilben-Bildung aus Phenylpropanoiden verhinderte. Untersuchungen der transkriptionellen Antwort von C. glutamicum auf die Anwesenheit von Phenylpropanoiden wiesen auf ein Gencluster hin, das für Enzyme bisher unbekannter Funktion codiert. Tatsächlich katalysieren diese Enzyme eine CoA-abhängige β-oxidative Verkürzung der Phenylpropanoid-Seitenkette zur Bildung von Hydroxybenzoesäuren, die über gut charakterisierte Abbauwege in C. glutamicum weiter verstoffwechselt werden können. Zusätzlich zum identifizierten Abbauweg erschwerte ein bereits weitestgehend bekanntes und komplexes Netzwerk aus anderen katabolen Stoffwechselwegen für aromatische Verbindungen in C. glutamicum die gewünschte Produktion von Polyphenolen in diesem Organismus. Durch Deletion von insgesamt 21 Genen in vier Genclustern im Genom wurde C. glutamicum DelAro4 als Plattform-Stamm für die Polyphenol-Synthese konstruiert, der aromatische Verbindungen nicht mehr metabolisieren kann. (2) Nach funktionaler Expression heterologer Gene aus verschiedenen Pflanzen produzierte C. glutamicum DelAro4 abhängig vom zugegebenen Phenylpropanoid entweder die Stilbene Pinosylvin, Resveratrol und Piceatannol oder die (2S)-Flavanone Naringenin und Eriodictyol. Dabei wurden Stilben-Konzentrationen von bis zu 158 mg/L und (2S)-Flavanon-Konzentrationen von bis zu 37 mg/L erreicht. Durch Einbringen weiterer Gene gelang ebenfalls die Synthese O-methylierter Stilbene und komplexerer Flavonoide. Die in C. glutamicum erreichten Flavonoid-Titer waren sogar höher als in der Literatur für etablierte mikrobielle Polyphenol-Produktionsstämme beschrieben. (3) Die Bildung von Resveratrol und Naringenin wurde in C. glutamicum auch ausgehend von Glucose ohne Zugabe von Vorläufermetaboliten erreicht. Dies wurde durch die Deregulation des Shikimat-Weges ermöglicht und führte zur Überproduktion von aromatischen Aminosäuren. Durch eine heterologe Tyrosin-Ammoniak-Lyase (TAL) konnte der endogene Aminosäuremetabolismus mit den Produktionswegen für Polyphenole verbunden werden. Es stellte sich heraus, dass die TAL-Aktivität für die Polyphenol-Produktion ausgehend von Glucose limitierend war. Um eine Phenylpropanoid-Synthese unabhängig von L-Tyrosin zu erreichen, wurde ein neuer synthetischer Weg ausgehend von der kostengünstigen 4-Hydroxybenzoesäure entwickelt und in C. glutamicum getestet. Der neue Weg stellt die nicht-natürliche Umkehrung eines bakteriellen Abbauweges für Phenylpropanoide dar und benötigt Acetyl-CoA und die Cofaktoren ATP und NADH. Erstmalig gelang so die Produktion von 5 mg/L Resveratrol aus 4-Hydroxybenzoesäure.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	08.12.2017
Dateien geändert am:	08.12.2017
Promotionsantrag am:	19.04.2017
Datum der Promotion:	17.10.2017