Dokument: Einfluss von Ischämie und ischämischer Präkonditionierung auf die Expression der microRNA-223 im Myokard der Ratte und Interaktion der microRNA-223 mit dem potentiellen Zielprotein PMCA1
| Titel: | Einfluss von Ischämie und ischämischer Präkonditionierung auf die Expression der microRNA-223 im Myokard der Ratte und Interaktion der microRNA-223 mit dem potentiellen Zielprotein PMCA1 | |||||||
| Weiterer Titel: | Effect of ischemia and ischemic preconditioning on the expression of microRNA-223 in the myocardium of the rat and interaction between microRNA-223 and its potential target protein PMCA1 | |||||||
| URL für Lesezeichen: | https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44339 | |||||||
| URN (NBN): | urn:nbn:de:hbz:061-20171206-105934-6 | |||||||
| Kollektion: | Dissertationen | |||||||
| Sprache: | Deutsch | |||||||
| Dokumententyp: | Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation | |||||||
| Medientyp: | Text | |||||||
| Autor: | Dr. med. Dipl.-Psych. Sen, Erkan [Autor] | |||||||
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| Beitragende: | Prof. Dr. Bauer, Inge [Gutachter] Prof. Dr. med. Akhyari, Payam [Gutachter] | |||||||
| Stichwörter: | microRNA, miR-223, myokardiale Ischämie, Ischämische Präkonditionierung (IPC), Ischämische Fernpräkonditionierung (RIPC), PMCA1 | |||||||
| Dewey Dezimal-Klassifikation: | 600 Technik, Medizin, angewandte Wissenschaften » 610 Medizin und Gesundheit | |||||||
| Beschreibungen: | EINLEITUNG
microRNAs (miRNAs) sind kleine, endogene, nicht-kodierende RNA-Moleküle, die durch Bindung an messengerRNA (mRNA) die Translation von Zielproteinen negativ beeinflussen können. miRNAs spielen auch bei myokardialer Ischämie eine wichtige Rolle. Die ischämische Präkonditionierung (IPC) und die ischämische Fernpräkonditionierung (RIPC) können einen Ischämie-Reperfusionsschaden nach myokardialer Ischämie reduzieren. Die PMCA1 (Plasma membrane Ca2+-ATPase) ist ein für die Mikroregulation von intrazellulärem Calcium und die zelluläre Apoptose wichtiges Transportprotein und wurde als mögliches Ziel der miR-223 bei miR-223-defizienten Mäusen durch eine Massenspektrometriemessung identifiziert. ZIELE Die bisher unbekannte differentielle myokardiale miR-223-Expression bei Ischämie und IPC/RIPC wurde mittels quantitativer Real-Time PCR (qPCR) untersucht. Außerdem wurde geprüft, ob die PMCA1 in einem Luciferase Assay tatsächlich ein Zielprotein der miR-223 ist. METHODEN Für die Messung der differentiellen miR-223-Expression wurden männliche Wistar-Ratten in sechs Gruppen randomisiert (jew. n = 6): 1. Scheinoperation (Sham; Kontrollgruppe); 2. 30-minütige Ischämie einer Koronararterie und 2h Reperfusion (I/R); 3. vier Zyklen einer IPC ohne nachfolgende I/R (IPC), 4. IPC wie in 3. mit nachfolgender I/R (IPC + I/R), 5. vier Zyklen einer RIPC ohne Ischämie einer Koronararterie (RIPC) und 6. RIPC wie in 5. mit nachfolgender I/R (RIPC + I/R). Das Infarktareal wurde mittels einer Farblösung (Evans blue) demarkiert und Gewebsproben aus dem Risikogebiet (sog. area at risk oder AAR) und Restherz (non-AAR) entnommen. Hieraus wurde RNA isoliert, mittels spezifischer Primer in cDNA transkribiert und die miR-223-Expression mit qPCR ermittelt. Zur Überprüfung der miR-223/PMCA1-Interaktion wurden die 3’-UTR-Sequenz der PMCA1 mit der putativen Bindungsstelle für miR-223 sowie die pre-miR-223 in Reporter- bzw. Expressionsplasmide einkloniert und in HEK 293-Zellen transfiziert (jew. n = 4). Die Aktivitätsunterschiede wurden mit Luciferase Assays gemessen. Die statistische Auswertung erfolgte jeweils mit t-Tests, p < 0,05 wurde als signifikant gewertet. ERGEBNISSE Die miR-223 war nach I/R in den AAR-Proben signifikant hochreguliert; am höchsten bei reiner Myokardischämie (I/R, ca. 26-fach, p < 0,01), niedriger bei IPC (ca. 16-fach, p < 0,01) oder bei RIPC (ca. 5-fach, p < 0,01). Im Nicht-Risikogebiet (non-AAR) war der Expressionsunterschied der miR-223 nur bei IPC signifikant erhöht (ca. 2,5-fach erhöht, p < 0,05). Die postulierte Interaktion zwischen der miR-223 und der PMCA1 konnte im Luciferase Assay nicht bestätigt werden: Die relative Luciferaseaktivität der Experimentalgruppe (ca. 0,99-fach) unterschied sich nicht zur Kontrollgruppe (p > 0,05). DISKUSSION Die miR-223-Expression ist im myokardialen Ischämiegebiet signifikant erhöht, die Hochregulation ist bei IPC und RIPC graduell geringer ausgeprägt. Die miR-223 gilt als neutrophil-spezifisch, die Hochregulation ist wahrscheinlich durch eine neutrophiläre Invasion in das Ischämiegewebe bedingt. Eine IPC oder RIPC könnte zu einer verminderten Invasion führen, was die geringere miR-223-Expression erklären würde. Für den fehlenden Nachweis einer miR-223/PMCA1-Interaktion im Luciferase Assay werden Kriterien für erfolgreiche miRNA-mRNA-Interaktionen überprüft; das Fehlen von AU-reichen Sequenzen der 3’-UTR außerhalb der Bindungsstelle und fehlende zusätzliche Bindungsstellen werden als Hauptursachen vermutet. Weitere Untersuchungen sind nötig, um die vermuteten Erklärungen überprüfen zu können.INTRODUCTION microRNAs (miRNAs) are small, endogenous, non-coding RNA molecules that can adversely affect the translation of target proteins by binding to their messengerRNA (mRNA). miRNAs also play an important role in myocardial ischemia. Ischemic preconditioning (IPC) and remote ischemic preconditioning (RIPC) can reduce ischemia reperfusion damage after myocardial ischemia. PMCA1 (plasma membrane Ca2+-ATPase) is a transport protein essential for the microregulation of intracellular calcium as well as cellular apoptosis and was identified as a possible target of miR-223 in miR-223-deficient mice by mass spectrometry. OBJECTIVES The unknown differential myocardial miR-223 expression after ischemia and IPC/RIPC was measured by quantitative real-time PCR (qPCR). Furthermore, it was investigated whether PMCA1 is a true target of miR-223 in luciferase assay experiments. METHODS In order to measure the differential miR-223 expression, male Wistar rats were randomized into six groups (n = 6): 1. sham (control group); 2. 30 min ischemia of a coronary artery and 2h of reperfusion (I/R); 3. four cycles of IPC without subsequent I/R (IPC), 4. IPC as in 3. with subsequent I/R (IPC + I/R), 5. four cycles of RIPC without ischemia of a coronary artery (RIPC) and 6. RIPC as in 5. with subsequent I/R (RIPC + I/R). The infarction area was assessed using Evans blue dye and tissue samples were taken from the so-called area at risk (AAR) and remaining heart (non-AAR). RNA was then isolated, transcribed into cDNA by specific primers and miR-223 expression was determined with qPCR. To investigate the alleged miR-223/PMCA1 interaction, the 3'-UTR sequence of PMCA1 with the putative binding site for miR-223 and pre-miR-223 were cloned into reporter and expression plasmids, respectively, and transfected into HEK 293 cells (n = 4). The differences in activity were measured with luciferase assay experiments. The statistical analysis was performed with t-tests, p < 0.05 was considered significant. RESULTS miR-223 was significantly upregulated after I/R in the AAR; the highest after myocardial ischaemia alone (I/R, approximately 26-fold, p < 0.01), lower with IPC (approximately 16-fold, p < 0.01) or with RIPC (approximately 5-fold, p < 0.01). In the non-AAR, the expression of miR-223 was only significantly increased in IPC (approximately 2.5-fold, p < 0.05). The alleged interaction between miR-223 and PMCA1 could not be confirmed in the luciferase assay experiments: the relative luciferase activity of the experimental group (about 0.99-fold) did not differ from the controls (p > 0.05). DISCUSSION The miR-223 expression is significantly increased in the ischemic region of the myocardium; the upregulation is gradually lower with IPC or RIPC. miR-223 is considered to be neutrophil-specific; the upregulation is probably due to a neutrophil invasion of the ischemic tissue. IPC or RIPC could result in a reduced invasion, which would explain the lower miR-223 expression. In an attempt to explain the missing miR-223/PMCA1 interaction in the luciferase assay experiments, several criteria for successful miRNA-mRNA interactions are evaluated; the absence of AU-rich sequences of the 3'-UTR outside the binding site and missing additional binding sites between miR-223/PMCA1 are believed to be crucial. Further investigation is needed to verify the presumed explanations. | |||||||
| Lizenz: |  Urheberrechtsschutz | |||||||
| Fachbereich / Einrichtung: | Medizinische Fakultät | |||||||
| Dokument erstellt am: | 06.12.2017 | |||||||
| Dateien geändert am: | 06.12.2017 | |||||||
| Promotionsantrag am: | 18.04.2017 | |||||||
| Datum der Promotion: | 29.11.2017 |
