Dokument: Accessing possible protective functions and interaction partners of Progranulin

Titel:	Accessing possible protective functions and interaction partners of Progranulin
URL für Lesezeichen:	https://docserv.uni-duesseldorf.de/servlets/DocumentServlet?id=44306
URN (NBN):	urn:nbn:de:hbz:061-20171130-114446-1
Kollektion:	Dissertationen
Sprache:	Englisch
Dokumententyp:	Wissenschaftliche Abschlussarbeiten » Dissertation
Medientyp:	Text
Autor:	Seegel, Julia [Autor]
Dateien:	[Dateien anzeigen] Adobe PDF [Details] 5,72 MB in einer Datei [ZIP-Datei erzeugen] Dateien vom 30.11.2017 / geändert 30.11.2017
Beitragende:	Prof. Dr. Weggen, Sascha [Gutachter] Prof. Urlacher, Vlada [Gutachter]
Stichwörter:	Progranulin, FTD
Dewey Dezimal-Klassifikation:	500 Naturwissenschaften und Mathematik » 570 Biowissenschaften; Biologie
Beschreibungen:	Frontotemporale Demenz (FTD) ist eine letale und unheilbare Erkrankung des Gehirns und verantwortlich für 5-10% aller Fälle von Demenz. FTD-Patienten zeigen Neurodegeneration im frontalen und temporalen Cortex und leiden unter einem fortschreitenden Wandel von Verhalten, Persönlichkeit und Sprache. Progranulin (GRN) spielt eine wichtige Rolle bei der Entstehung der Krankheit. In Patienten mit familiärer FTD wurden inaktivierende Mutationen im GRN-Gen gefunden, die eine Absenkung des GRN-Levels verursachen. GRN ist ein sekretiertes Glykoprotein mit Eigenschaften eines Wachstumsfaktors. Es setzt sich aus 7,5 Wiederholungen eines hochkonservierten und cysteinreichen Granulinmotivs zusammen und kann von verschiedenen Proteasen in Granulinpeptide gespalten werden. Zu Beginn dieser Arbeit waren die pathogenen Mechanismen weitgehend unbekannt, die durch reduzierte Expression von GRN den Verlust von Neuronen verursachen. Ziel dieser Arbeit war es einen funktionalen Bioassay zu entwickeln und neue Interaktionspartner von GRN zu identifizieren, um das Verständnis der physiologischen und pathologischen Funktionen von GRN zu verbessern. Als Voraussetzung für das Etablieren eines Bioassays wurde ein Protokoll zur Expression von humanem GRN in HEK293T Zellen und dessen Aufreinigung via Affinitätschromatographie entwickelt. Das daraus resultierende hochreine Protein wurde in einem Assay für oxidative Glutamattoxizität auf zytoprotektive Eigenschaften getestet. In diesem Assay wird die murine hippokampale HT22 Zelllinie mit Glutamat behandelt, was zu einer Akkumulation von reaktiven Sauerstoffspezies führt, die den Zelltod verursachen. Rekombinantes GRN konnte die HT22 Zellen nicht vor der Glutamattoxizität schützen. Im Gegensatz dazu zeigten die Granuline, generiert durch in vitro Proteolyse des rekombinanten GRNs, eine starke neuroprotektive Wirkung. Bei einer Behandlung mit Glutamatkonzentrationen, die >50% der Kontrollzellen töteten, wurde die Viabilität der Zellen vollständig erhalten, die zusätzlich mit Granulinen behandelt wurden. Um neue Interaktionspartner von GRN zu identifizieren wurde ein Yeast-2-Hybrid (Y2H) Screen wurde durchgeführt. Zuerst wurde die Methode in unserem Labor etabliert, indem der C-Terminus von APP gegen eine humane cDNA Bibliothek gescreent wurde. In diesem Kontroll-Screen wurde ein bekannter APP-Interaktionspartner, Fe65L1, wiederholt isoliert, was die erfolgreiche Implementierung der Methode zeigte. Das humane volle Länge GRN war nicht einsetzbar für einen Screen, da es eine ausgeprägte Autoaktivierung der Y2H-Reportergene verursachte. Eine extensive Deletionsanalyse zeigte jedoch, dass die Granulindomaine F dafür verantwortlich war. Folglich wurde Granulin F aus dem finalen Bait-Protein eliminiert. In diesem Screen wurde ein hoher Hintergrund von unspezifischen Interaktionen beobachtet. Insgesamt 10 Proteine wurden als echte positive Hits klassifiziert, deren zelluläre Lokalisation eine Interaktion mit GRN im sekretorischen Weg oder im extrazellulären Raum zulässt. Drei dieser Kandidaten zeigten eine Rezeptor-ähnliche Struktur (TMEFF2, NRXN1, LRRN3). Im Verlauf dieser Arbeit wurde die Expression und Aufreinigung von rekombinantem GRN in Säugetierzellen optimiert und für die Etablierung eines zellbasierten Bioaktivitätsassays für Granuline verwendet. Dieser Assay kann potentiell für ein genetisches Screening angepasst werden und könnte außerdem dafür verwendet werden spezifische Rezeptoren von Granulinen zu isolieren. Überdies kann eine Bestätigung der identifizierten GRN-Interaktionspartner zu einem besseren Verständnis von GRN führen und einen Ausgangspunkt für die Entwicklung von neuen therapeutischen Interventionen liefern. Frontotemporal dementia (FTD) is a fatal brain disease responsible for 5-10% of all dementia cases. FTD patients suffer from neurodegeneration in the frontal and temporal cortex and progressive abnormalities in behavior, personality and language. Progranulin (GRN) plays an important role in the pathogenesis as patients with familial forms of FTD harbor inactivating mutations in the GRN gene causing reduced protein levels. GRN is a secreted glycoprotein with growth factor-like properties. It is comprised of 7.5 repeats of a conserved cysteine-rich granulin motif and can be cleaved by proteases into small granulin peptides. At the start of this thesis project not much was known about the pathological mechanisms through which reduced GRN expression might cause neuronal loss. The aims of this thesis were to develop a functional bioassay for GRN and to identify novel interaction partners of GRN in order to improve the understanding of its physiological and pathological functions. As a precondition to establish a bioassay, a protocol for the expression of human GRN in HEK293T cells and for its purification by affinity chromatography was developed. The highly pure recombinant protein was then tested for protective activity against oxidative glutamate toxicity. In this assay, treatment of the murine hippocampal HT22 cell line with glutamate promotes the accumulation of intracellular reactive oxygen species resulting in cell death. Recombinant full-length GRN did not rescue HT22 cells from glutamate toxicity. Importantly, granulin peptides generated by in vitro proteolysis of recombinant GRN were strongly neuroprotective in this assay, fully preserving the viability of HT22 cells in the presence of glutamate concentrations that killed > 50% of control cells. To identify novel binding partners of GRN, a yeast-2-hybrid (Y2H) screen was performed. First, to establish the Y2H method in the laboratory, the APP C-terminus was used as bait and screened against a human brain cDNA library. In this control screen, FE65L1, a known binding partner of APP was repeatedly isolated, indicating that the multi-step Y2H procedure was successfully implemented. The full-length human GRN protein was not suitable for screening because of auto-activation of the Y2H reporter genes. However, through extensive deletion analysis, the granulin F domain was identified as responsible and eliminated from the final bait construct. In the GRN Y2H screen a high background of non-specific interactions was observed. 10 proteins were classified as true positive hits with a cellular localization allowing interaction with GRN in the secretory pathway or the extracellular space. Three of these candidates displayed a receptor-like structure (TMEFF2, NRXN1, LRRN3). In summary, in the scope of this thesis, the expression and purification of recombinant GRN was optimized in mammalian cells and used to establish a cell-based bioactivity assay for granulin peptides. This assay is potentially adaptable to genetic screening and could be employed to isolate specific receptors for granulin peptides. In addition, confirmation of GRN binding partners within the Y2H candidate proteins could lead to a better understanding of GRN and provide a starting-point for the development of novel therapeutic interventions.
Lizenz:	Urheberrechtsschutz
Fachbereich / Einrichtung:	Medizinische Fakultät » Institute » Institut für Neuropathologie Mathematisch- Naturwissenschaftliche Fakultät
Dokument erstellt am:	30.11.2017
Dateien geändert am:	30.11.2017
Promotionsantrag am:	13.06.2017
Datum der Promotion:	08.11.2017